多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析415例成人和兒童B【摘要】為了探討FCM在微量殘留病檢測(cè)中的意義，利用4-6組4色抗體組合，以CD45/SSC設(shè)門法對(duì)273例成人和142例兒童B系急性淋巴細(xì)胞白血病患者進(jìn)行了多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)免疫分型檢測(cè)和白血病相關(guān)免疫表型分析。結(jié)果表明：根據(jù)CD34和CD10的表達(dá)特點(diǎn)，可將B-ALL患者分為I型；Ⅱ型；Ⅲ型；Ⅵ型。Ⅰ型和Ⅱ型患者LAIP的陽性比例分別為100%和92%，但Ⅲ型患者LAIP陽性率只有%,顯著低于Ⅰ型和Ⅱ型患者。總體B-ALL患者LAIP的檢出率為90%，成人與兒童組無明顯差異。而利用CD34/CD10/CD19/CD45一組抗體，LAIP檢出率達(dá)到%。結(jié)論：90%成人和兒童B-ALL白血病患者具有LAIP，因此對(duì)這類患者適宜用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)。

【關(guān)鍵詞】急性B系白血病；白血病相關(guān)免疫表型;多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)

Leukemia-AssociatedImmunophenotypesin415ChildhoodandAdultPatientswithBLineageAcuteLymphoblasticLeukemiaMultiparametricFlowCytometryAnalysis

AbstractToevaluatethesignificanceofFCMinminimalresidualdisease(MRD)detection,theimmunophenotypingandleukemia-associatedimmunophenotypes(LAIP)ofleukemiacellsfrom273adultand142childhoodpatientswithBlineageacutelymphoblasticleukemia(B-ALL)weredetectedbyfourtosixantibodycombinationsof4-colorCD45/SSCgatingmultiparametricflowcytometry(FCM).TheresultsshowedthattheB-ALLpatientscouldbeclassifiedinto4subtypesbasedondifferentexpressionCD34andCD10:subtypeⅠ,subtypeⅡ,subtypeⅢ,subtypeⅣ.TheLAIPwasobservedin100%and92%patientsofsubtypeⅠandsubtypeⅡ,respectively,whereasonly%insubtypeⅢ.TheincidenceofLAIPintotalB-ALLcaseswas90%byusingtheantibodiesdetectedinthisinvestigation.TherewasnosignificantcedifferentforincidenceofLAIPbetweenadultandpediatricpatients.LAIPwasobservedin%ofpatientsbylabelingonlyCD34/CD10/CD19/CD454-colorantibodycombination.Itisconcludedthatin90%ofchildhoodandadultB-ALLpatientsLAIPcanbefound,whichsuitsMRDdetectionbymultiparameterflowcytometry.

KeywordsacuteBlineageleukemia;leukemia-associatedimmunophenotypes；multiparametricflowcytometry

B細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病免疫亞型的MIC診斷標(biāo)準(zhǔn)自1985年起一直沿用至今，并且被新的WHO分類標(biāo)準(zhǔn)所采用。該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)胞漿免疫球蛋白和細(xì)胞核內(nèi)抗原TdT及表面免疫球蛋白、HLA-DR和CD10，將B-ALL分為：early-precursors-B-ALL,commom-B-ALL,pre-B-ALL和B-ALL4亞型。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞漿抗原的表達(dá)，操作較煩瑣，有一定難度，且結(jié)果不穩(wěn)定，因此其在臨床的常規(guī)檢測(cè)中應(yīng)用受到限制。1997年Jennings等［1］提出將B-ALL分為：B-precursor-ALL,pre-B-ALL和B-ALL3亞型，又將B-precursor-ALL,分為CD10+和CD10-兩類。該系統(tǒng)在MIC基礎(chǔ)上加入CD34、CD20、CD22、CD24、CD9抗原。近幾年多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用促進(jìn)了對(duì)正常B細(xì)胞分化階段抗原表達(dá)的認(rèn)識(shí)，但是否可通過簡便的抗原檢測(cè)而達(dá)到對(duì)B-ALL進(jìn)行亞型的分型，本研究對(duì)此進(jìn)行了初步探討。雖然B-ALL患者的白血病細(xì)胞在抗原表達(dá)類型和出現(xiàn)的順序與正常B祖細(xì)胞基本相似，但白血病細(xì)胞具有一些正常細(xì)胞不存在或存在比例較低的抗原表達(dá)特點(diǎn)，可作為辨認(rèn)白血病細(xì)胞的標(biāo)志，文獻(xiàn)上對(duì)其稱為白血病相關(guān)免疫表型［2］。利用FCM通過檢測(cè)LAIP可對(duì)B-ALL微量殘留病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，這一方法已成為與聚合酶鏈反應(yīng)并用的檢測(cè)MRD的主要方法。目前國際上對(duì)B-ALL-MRD的檢測(cè)結(jié)果多來自兒童患者，而且主要的研究對(duì)象為前體B-ALL。而成人B-ALL患者在免疫表型尤其是LAIP與兒童患者是否存在區(qū)別？FCM-MRD的檢測(cè)是否同樣適合于成人B-ALL患者？及兒童和成人不同亞型B-ALL患者中LAIP的陽性率是否相同？均不十分清楚。本室在掌握了正常B祖細(xì)胞免疫表型的基礎(chǔ)上［3］，對(duì)415例成人和兒童B-ALL患者的上述問題進(jìn)行了研究，以探討其在MRD檢測(cè)中的意義。

材料和方法

研究對(duì)象

2000年8月至2005年6月在我室進(jìn)行免疫分型檢測(cè)的B-ALL患者共415例，其中初治409例，復(fù)發(fā)6例。成人組273例，中位年齡32歲，男160例，女113例。兒童組142例，中位年齡9歲，男89例，女53例。

B-ALL患者的免疫分型檢測(cè)

取肝素抗凝的骨髓或外周血標(biāo)本，利用我室設(shè)計(jì)的4色熒光直接免疫標(biāo)記法進(jìn)行B-ALL的免疫分型檢測(cè)，以CD45/SSC設(shè)門，故每管均加CD45-PerCP抗體。主要標(biāo)記4-6管4色抗體組合，檢測(cè)的抗原分別為CD19、CD10、CD34、CD20，CD22，HLA-DR、CD13、CD33、CD14、CD5、CD7、CD2、CD38、CD117，CD11b等。經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACSort型，BectonDickinson公司，裝備雙激光管)測(cè)定時(shí)將正常淋巴細(xì)胞的CD45熒光值調(diào)到103左右。每份標(biāo)本獲取10000個(gè)細(xì)胞。分析時(shí)以幼稚細(xì)胞群中抗原表達(dá)細(xì)胞20%作為陽性。由于在儀器設(shè)定時(shí)將正常淋巴細(xì)胞的CD45熒光值調(diào)到103左右，此時(shí)正常B系祖細(xì)胞的CD45全部101,因此CD45抗原以90%細(xì)胞101定為CD45陽性，90%細(xì)胞101定為CD45陰性，90%細(xì)胞101到102定為CD45弱陽性。B-ALL免疫分型的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［4］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用成對(duì)樣本t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。

結(jié)果

B-ALL免疫分型

本組B-ALL患者中，CD19全部陽性。由于正常B細(xì)胞的不同分化階段CD34和CD10表達(dá)具有明顯的階段性，并且白血病細(xì)胞基本保留此特性，因此我們參考MIC分類標(biāo)準(zhǔn)，并主要根據(jù)CD34和CD10的表達(dá)，將B-ALL患者共分為4亞型：Ⅰ型:CD34+/CD10-，相當(dāng)于MIC分類Early-precursor-B-ALL(Pre-pre-B-ALL);Ⅱ型:CD34+/CD10+,相當(dāng)于普通B-ALL(c-B-ALL)；Ⅲ型:CD34-/CD10+，相當(dāng)于前B-ALL。其它各型比例在兒童與成人和與總體相比均無顯著性差異。Table1.FrequencyofimmunophenotypicsubtypesinadultandchildpatientswithB-ALL

B-ALL患者LAIP分析

通過與正常B祖細(xì)胞進(jìn)行比較［2］，在總體B-ALL中LAIP的主要表現(xiàn)為：①抗原表達(dá)異常，以CD45表達(dá)異常減弱，缺如最為多見，在總體B-ALL患者中占%。而且在4個(gè)亞型中均可見到，這說明完全喪失了分化階段的特性。其它抗原表達(dá)異常包括CD19、CD10、CD34異常高表達(dá)和異常低表達(dá);②非同步抗原表達(dá)，如Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型B-ALL患者的白血病細(xì)胞，在正常CD19+B系細(xì)胞相應(yīng)發(fā)育階段除CD34和CD10抗原外，CD22、CD38和CD20表達(dá)應(yīng)為CD22+CD38+CD20-、CD22+CD38+CD20+/-和CD22+CD38-CD20+;但白血病細(xì)胞可出現(xiàn)CD34+CD20+、CD34-CD10-CD20-、CD34-CD10-CD22-、CD34+CD38-、CD10+CD38-非同步抗原表達(dá)異常；③交叉系列抗原表達(dá)，如同時(shí)表達(dá)髓系和T系標(biāo)志。通過本研究所檢測(cè)的抗體，415例B-ALL患者中373例患者具有可供MRD檢測(cè)的LAIP，其中利用CD10/CD34/CD19/CD45一組抗體，LAIP的檢出率達(dá)到%。Table2.IncidenceofLAIPin415adultandchildpatientswithB-ALL

Note:st+-strongpositive.

B-ALL各亞型中白血病相關(guān)的免疫表型分析

本研究所檢測(cè)的主要抗原的異常表達(dá)在各亞型中的比例見表3和表4。CD45和CD38異常弱表達(dá)和CD34、CD19和CD10的強(qiáng)表達(dá)主要見于Ⅱ型患者，使Ⅱ型患者總體LAIP陽性率達(dá)%。CD33和CD56的異常表達(dá)以Ⅰ型患者多見，且正常CD19+B祖細(xì)胞基本不存在CD34+CD10-表型，此型患者全部為LAIP+，即均可通過免疫表型檢測(cè)MRD。Ⅲ型患者由于CD34陰性，CD10表達(dá)也已經(jīng)減弱，只有CD20全部陰性占%,高于Ⅰ型和Ⅱ型，但其他標(biāo)志異常率也較低，其總LAIP+率只有%，比Ⅰ和Ⅱ型低，但只與Ⅰ型相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)Ⅳ型患者，由于其CD34和CD10均為陰性，因此失去了2個(gè)非常有意義的標(biāo)志，LAIP陽性率最低。與其它3型比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但我們發(fā)現(xiàn)6/7例患者CD20為陰性，而此期的正常B細(xì)胞，CD20應(yīng)強(qiáng)陽性，因此通過CD20的檢測(cè)可能利于Ⅳ型患者M(jìn)RD的監(jiān)測(cè)。雖然表4顯示Ⅳ型患者LAIP陽性率為%，但LAIP陰性的7名患者均未檢測(cè)CD22和CD20，因此，如果每位Ⅳ型患者均檢測(cè)此兩種抗體，則實(shí)際LAIP陽性率可能會(huì)大大增加。Table3.FrequencyofLAIPpositivepatientsinsubtypeofB-ALL(略)

成人和兒童組B-ALL患者白血病相關(guān)的免疫表型分析

表4顯示成人和兒童組B-ALL患者白血病相關(guān)的免疫表型陽性比例，兒童組中LAIP陽性率為%，成人組為%,兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而兒童和成人B-ALL各亞型之間及與總體之間均無顯著差異。這一結(jié)果說明FCM同樣適合于成人B-ALL患者M(jìn)RD的監(jiān)測(cè)。Table4.PercentageofLAIPpositivepatientsinsubtypeofB-ALL

討論

近幾年，由于多參數(shù)FCM的建立和應(yīng)用，我們對(duì)正常B細(xì)胞分化階段抗原表達(dá)有了新的認(rèn)識(shí)。文獻(xiàn)報(bào)道和我們的結(jié)果均說明利用CD34/CD10/CD19/CD45可將正常B細(xì)胞從最早期到成熟期進(jìn)行分型。而1985年提出的MIC標(biāo)準(zhǔn)所依據(jù)的抗原中CD19和HLA-DR在B細(xì)胞分化全程表達(dá)，而對(duì)B-ALL來講，HLA-DR不是一個(gè)特異性的標(biāo)志，因此在診斷B-ALL進(jìn)行時(shí)可不必檢測(cè)此抗原。TdT和CD10的表達(dá)在正常B祖細(xì)胞不同分化階段具有明顯的階段性，而文獻(xiàn)報(bào)道［5］和我們的結(jié)果證明，正常B祖細(xì)胞中CD34與TdT的表達(dá)具有一致性。雖然文獻(xiàn)報(bào)道pre-B-ALLTdT為陽性,而相應(yīng)的同期正常B祖細(xì)胞CD34和TdT應(yīng)為陰性，但Jennings等［1］與我們的結(jié)果，均顯示pre-B-ALL中CD34為陰性。這說明TdT在B-ALL中的表達(dá)喪失了分化階段特異性，因此利用CD34抗原作為亞型的分型標(biāo)志優(yōu)于TdT。cIg和sIg是很好的抗原標(biāo)志，不足之處是cIg的標(biāo)記操作較繁瑣，同時(shí)標(biāo)記cIg和sIg也增加檢測(cè)費(fèi)用。我們檢測(cè)了B祖細(xì)胞中cIg和sIg的表達(dá)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相同［7］，cIg表達(dá)見于CD34-CD10+階段，屬于CD19+B系分化的第Ⅱ期，sIg表達(dá)見于CD34-CD10dim階段，屬于B系分化的第Ⅲ期,因此我們主要依據(jù)CD34和CD10的表達(dá)將B-ALL患者分為4種亞型。對(duì)Ⅰ型B-ALL，我們的結(jié)果說明在正常CD19+B祖細(xì)胞中無明顯的CD34+CD10-細(xì)胞，而近幾年多參數(shù)FCM檢測(cè)的文章中也未證明存在此群細(xì)胞，但有文獻(xiàn)報(bào)道存在TdT+CD10+CD19-和CD34+CD10+CD19-早期幼稚細(xì)胞［5,6］。因此CD34+CD10-CD19+細(xì)胞是否屬于B細(xì)胞分化的最早期階段，尚無定論。但B系A(chǔ)LL患者中，有14%患者CD34陽性而CD10陰性，且與MIC分型中earlyPrecursors-B-ALL相似，故將其定為Ⅰ型。MIC分型中的c-B-ALL，指CD10陽性但cIg和sIg均陰性的患者，實(shí)際上與CD34+CD10+發(fā)育階段一致。Ⅲ型與MIC分型中的Pre-B-ALL相同。我們未系統(tǒng)檢測(cè)B-ALL中CD34的TdT關(guān)系，但文獻(xiàn)報(bào)道，Pre-B-ALL患者TdT+/-。現(xiàn)在看來，CD34+TdT-應(yīng)屬于LAIP的一種。本組兒童B-ALL的分類結(jié)果與1993年前依據(jù)MIC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型的大宗標(biāo)本的結(jié)果［8］基本一致。但當(dāng)時(shí)對(duì)成人B-ALL患者的亞型分類中，由于缺乏cIg的資料，因此成人中Pre-B-ALL的比例不詳。這說明成人B-ALL中cIg的檢測(cè)并不普遍，影響了成人B-ALL的亞型分型。本研究利用CD34/CD10/CD19/CD45抗體組合，不僅可對(duì)B-ALL進(jìn)行分型，又彌補(bǔ)了MIC中的不足，還可用于LAIP檢測(cè)和MRD隨訪。目前對(duì)CD22抗原表達(dá)的認(rèn)識(shí)已有更新。Lucio［9］、McKenna［5］和我們的結(jié)果均證明，在B系祖細(xì)胞分化發(fā)育的早期，即表達(dá)CD22，且CD20主要為陰性，因此CD34+CD22+CD20-是Ⅰ期B祖細(xì)胞的正常表型，并非LAIP。而2002年發(fā)表的WHO白血病和淋巴瘤的新分類標(biāo)準(zhǔn)中［10］，還認(rèn)為早期的B祖細(xì)胞為CD22陰性。1999年前發(fā)表的文章中，有將CD34和CD22同時(shí)陽性和CD34+CD22+CD20-歸于LAIP［1］。現(xiàn)在分析，這些應(yīng)為正常表型。造成如此大差異的主要原因是CD22抗體所連接的熒光素不同，如CD22-FITC，該熒光素的熒光強(qiáng)度較弱。相似的原因可能造成不同的文獻(xiàn)某些抗原表達(dá)的差異，如髓系標(biāo)志的表達(dá)。而FITC和PE標(biāo)記的CD20的表達(dá)基本是一致的。FCM主要通過檢測(cè)LAIP來鑒別白血病細(xì)胞。對(duì)B-ALL患者，文獻(xiàn)報(bào)道LAIP主要有4種表現(xiàn)［11-13］：①非同步抗原同時(shí)表達(dá)，如CD34和胞漿μ鏈同時(shí)陽性;②交叉系列抗原表達(dá)，如B-ALL細(xì)胞同時(shí)表達(dá)髓系和T系標(biāo)志;③抗原表達(dá)量異常,如CD10、CD34、CD19過強(qiáng)表達(dá)和CD38，CD45等表達(dá)缺失及低表達(dá);④光散射信號(hào)改變,包括側(cè)向光散射、前向光散射。本研究結(jié)果中，LAIP主要表現(xiàn)為抗原表達(dá)量的異常，以CD45弱表達(dá)或表達(dá)缺失最為常見，其它抗原異常依次為CD19、CD38、CD10、CD34。交叉系列抗原：髓系或T系表達(dá)占24%，而CD56表達(dá)率達(dá)到21%。非同步抗原同時(shí)表達(dá)主要見于CD20與CD38。而光散射信號(hào)改變?cè)诎l(fā)病時(shí)表現(xiàn)較明顯，但在MRD的檢測(cè)中，難以利用此標(biāo)志進(jìn)行鑒別。根據(jù)本研究所覆蓋的抗體數(shù)量，發(fā)現(xiàn)90%的B-ALL患者具有LAIP，可利用FCM檢測(cè)MRD。此比例與文獻(xiàn)報(bào)道相似。但已發(fā)表的文章多數(shù)只研究了前體B-ALL，而我們的分析對(duì)象是所有B-ALL患者，包括成熟型B-ALL，因此本研究更全面地反映了B-ALL的異常免疫表型特點(diǎn)。我們首次分析了不同亞型B-ALL患者LAIP的檢出率。結(jié)果表明，對(duì)Ⅰ型患者，100%患者適用于FCM-MRD檢測(cè)。對(duì)Ⅱ型患者，其LAIP的檢出率可達(dá)%,與文獻(xiàn)報(bào)道相似。但對(duì)于Ⅲ型患者，LAIP的檢出率明顯減低只有%。本組資料中，有1例檢測(cè)失敗者也屬此型。這說明部分Ⅲ型B-ALL患者難以利用FCM檢測(cè)MRD。Ⅳ型患者比例較低，如果增加CD20和CD22的檢測(cè)，可望增加此型患者FCM-MRD的檢測(cè)比例。對(duì)兒童和成人B-ALL患者，本研究材料表明：兒童和成人B-ALL的LAIP陽性率無明顯不同。這說明FCM同樣可適宜成人B-ALLMRD的檢測(cè)，而成人ALL患者預(yù)后明顯差于兒童患者，因此應(yīng)加強(qiáng)治療后MRD的監(jiān)測(cè)，以提高成人ALL患者的預(yù)后判斷。

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