植物內(nèi)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基的初探【摘要】從高活性菌株到獲得高產(chǎn)量活性產(chǎn)物之間，發(fā)酵是一個重要環(huán)節(jié)。本研究設(shè)計4種內(nèi)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基，對89株分離自傣藥植物且具有高抗菌活性的內(nèi)生菌及5株潛在放線菌新種進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液的提取物用3種展層系統(tǒng)作薄層色譜(TLC)展層，用UV(254nm、366nm)和茴香醛試劑進行檢測。實驗結(jié)果表明，用1號和4號培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的種類最豐富，2號和3號培養(yǎng)基產(chǎn)生的較少；用II號展層系統(tǒng)(氯仿∶甲醇=4∶1)和III號展層系統(tǒng)(正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5)作TLC層析，檢測到的產(chǎn)物最多；3種檢測方法以茴香醛檢測到的代謝產(chǎn)物最豐富。對每一株菌而言，產(chǎn)生最多產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基各不相同，為了獲得盡可能多的次生代謝產(chǎn)物，不同菌株選用的發(fā)酵培養(yǎng)基不一樣。探究適合的發(fā)酵培養(yǎng)條件，為活性產(chǎn)物的分離、制備奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】植物內(nèi)生菌；發(fā)酵培養(yǎng)基；TLC

ABSTRACTFermentationof89endophytesand5novelspeciescandidatesofactinomyceteswerecarriedoutbyfourdifferentfermentationmedia.ThreedevelopingsystemswereusedforchromatographyofTLC.UV254nm,366nmandanisaldehydeasachromogenicagentwereusedfordetectingcompoundsofthesestrains.Resultsindicatethatthemetabolitesofthesestrainswerethemostabundantwhenthesestrainswerefermentedinandmedia,andonlyfewinandMetabolitesofeachstrainweredifferentindifferentmedia.MoremetabolitescouldbedetectedwhentheTLCwascarriedoutinsystemII(chloroform∶methanol=9∶1)andsystemIII(butanol∶aceticacid∶water=4∶1∶5)withanisaldehydetestsolution.Theseresultestablishedabasefordesigningoffermentationmedium,isolationandpurificationofeffectivecompoundsfordiscoveryofnewleadercompoundsfromendophytes.

KEYWORDSPlantendophytes;Fermentationmedium;TLC

至今已描述的放線菌達40個科、180多屬、4000多種［1］，從中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)達11000種之多［2］，目前臨床和農(nóng)牧業(yè)上應(yīng)用的抗生素有60%以上是放線菌生產(chǎn)的。當(dāng)今要從普通環(huán)境微生物發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)越來越困難，其中去重復(fù)就是一道難題［3］。但是，自然界仍然存在至少90%以上的未知微生物［2，4～6］，其中植物內(nèi)生菌越來越受人們的重視［7］。為了充分利用云南豐富的植物內(nèi)生菌資源，從中發(fā)現(xiàn)

菌種

從云南西雙版納傣藥植物分離篩選到89株抗腫瘤、抗作物病原菌的高活性內(nèi)生菌菌株，其中50株放線菌、10株真菌、29株細菌；另外有5株具有抗菌活性的放線菌潛在新種，共94個菌株。

斜面培養(yǎng)基

真菌PDA固體培養(yǎng)基［8］。

細菌和放線菌酵母膏4g，葡萄糖4g，麥芽膏5g［9］，復(fù)合維生素，微量鹽1ml/L，瓊脂20g，1L水，。

復(fù)合維生素維生素B11mg，維生素B61mg，核黃素1mg，煙酸1mg，苯丙氨酸1mg，維生素H1mg，丙胺酸［10］。

微量鹽FeSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，ZnSO4·7H2O；水100ml。

發(fā)酵培養(yǎng)基

1號培養(yǎng)基黃豆粉10g，甘露醇10g，水1L，～。

2號培養(yǎng)基可溶性淀粉20g，脫脂大豆粉10g，硫代硫酸鈉，F(xiàn)eSO4·7H2O，K2HPO4，KCl，水1L，。

3號培養(yǎng)基葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉1g，牛肉膏，NaCl，CaCO3，水1L，。

4號培養(yǎng)基大豆粉30g，葡萄糖20g，淀粉5g，酵母膏2g，NaCl4g，K2HPO4，MgSO4·7H2O，CaCO32g，水1L，。

將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)6～7d，轉(zhuǎn)接于4種發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)，放線菌發(fā)酵7d，真菌和細菌6d。

發(fā)酵樣品提取物制備

發(fā)酵液加入等體積95%乙醇，28℃震蕩4h，靜置后吸取2ml上清液于試管，55℃蒸發(fā)乙醇后真空冷凍干燥，再加入100μl甲醇溶解提取物，用于高效薄層色譜(TLC)分析。

TLC分析

用毛細管點樣于硅膠GF254薄層板上，用三種展層體系和三種檢測條件進行分析。

三種展層體系

I：氯仿∶甲醇(9∶1)；

II：氯仿∶甲醇(4∶1)；

III：正丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶5，用上層)。

三種檢測條件

選取常用的254nm熒光淬滅成像檢測、366nm熒光成像檢測和具有廣譜性的茴香醛硫酸溶液顯色檢測。茴香醛硫酸溶液(母液)：乙醇∶冰乙酸∶濃硫酸(85∶10∶5)；100ml母液加入1ml茴香醛。

HPLC分析

甲醇溶解的樣品用μm孔徑的濾膜過濾，10μl進樣于HPLC儀。色譜柱為ZorbaxEclipseXDBC18(250mm×，5μm)，波長254nm，柱溫40℃，流速/min，流動相為甲醇和超純水，并在40min內(nèi)使甲醇比例從20%到90%線性梯度洗脫，之后在90%保持10min。

儀器與試劑

真空冷凍干燥機為英國Edwards公司產(chǎn)品；薄層數(shù)碼成像儀為瑞士CAMAG公司Repostar3型產(chǎn)品；高效液相色譜儀為美國Agilent1100系列；薄層硅膠GF254板為青島海洋化工廠生產(chǎn)。所用試劑均為分析純。

2結(jié)果及討論

由于實驗菌株發(fā)酵后所產(chǎn)生的有效成分尚不清楚，因此從菌株生長情況和產(chǎn)生的化合物條帶的多少初步評判發(fā)酵培養(yǎng)基的好壞。

菌株生長情況

94株菌在4種發(fā)酵培養(yǎng)基中均能生長，在1號和4號培養(yǎng)基中的生長比在2號和3號培養(yǎng)基中生長得好。

TLC檢測結(jié)果

94株菌的4種發(fā)酵液提取物，采用標(biāo)準(zhǔn)化程序：三種展層體系展層和三種檢測條件的TLC分析，薄層掃描儀掃描、儲存(統(tǒng)計結(jié)果見和)、檢索比較后，將存在未知化合物的產(chǎn)生菌作為進一步實驗的材料。

后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物條帶數(shù)目明顯多于2號和3號；4號培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物條帶總數(shù)又多于1號培養(yǎng)基，3號培養(yǎng)基所檢測到的數(shù)目最少。例如，94個菌株用4號培養(yǎng)基發(fā)酵提取物，用氯仿∶甲醇(4∶1)展層，254nm、366nm、茴香醛檢測的結(jié)果，分別共有387、346、394個條帶，1號培養(yǎng)基分別有297、303、300個條帶，而3號培養(yǎng)基僅有81、142、198個條帶。

在相同的展開體系和檢測條件下比較Rf值，結(jié)果顯示，相同菌株在不同的培養(yǎng)基中產(chǎn)生不完全相同的條帶，盡管4號培養(yǎng)基產(chǎn)生的化合物條帶最多，但其它培養(yǎng)基也能產(chǎn)生一些4號培養(yǎng)基不能產(chǎn)生的化合物。也就是說，同一個菌株在不同培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物是不一樣的。

通過不同菌株4種培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的TLC結(jié)果比較，94株菌中有49株在1號培養(yǎng)基中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物條帶最多，42株在4號培養(yǎng)基中最好，另外3株為2號培養(yǎng)基。本實驗的放線菌(包括5個潛在新種)、真菌、細菌用4種培養(yǎng)基發(fā)酵的結(jié)果同樣是1、4號培養(yǎng)基的條帶多于2、3號()，但每一株菌產(chǎn)生最多產(chǎn)物的培養(yǎng)基各不相同。所以，為了獲得盡可能多的代謝產(chǎn)物，不同菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)有所不同。

是用1、4培養(yǎng)基發(fā)酵，產(chǎn)生產(chǎn)物較多的10株菌的檢測結(jié)果。可以看出，1號培養(yǎng)基有3株的條帶在10條以上，4號培養(yǎng)基只有1株產(chǎn)生8個條帶，1株7個條帶，3株6個條帶。

不同展層系統(tǒng)、不同檢測條件的效果

3種展層系統(tǒng)的極性從小到大。和的結(jié)果表明，各個展層系統(tǒng)的展層效果明顯不同。II系統(tǒng)(氯仿∶甲醇=4∶1)在三個系統(tǒng)中屬中等極性，檢測到的條帶最多，總條帶有3039個；I系統(tǒng)(氯仿∶甲醇=9∶1)有2708個，III系統(tǒng)(正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5)只有2616個。不同的檢測條件檢測到的結(jié)果

HPLC檢測結(jié)果

選取部分菌株樣品進行HPLC檢測，結(jié)果顯示，不同菌株產(chǎn)生的次生物質(zhì)存在明顯差異，相同菌株在不同培養(yǎng)基中也存在一定的差異。在254nm波長的檢測條件下，用1號培養(yǎng)基發(fā)酵后產(chǎn)生的產(chǎn)物比其它培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)物多，結(jié)果與TLC檢測結(jié)果相對應(yīng)。為具有高抗菌活性的植物內(nèi)生放線菌菌株YIM48790(Dactylosporangium屬的潛在新種)和YIM56167采用1號培養(yǎng)基發(fā)酵后的次生代謝產(chǎn)物。圖中明顯看出，兩株放線菌通過1號培養(yǎng)基發(fā)酵后產(chǎn)生了大量次生代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的組成也大不一樣。

3討論

89株植物內(nèi)生菌、5株放線菌潛在新種采用4種培養(yǎng)基進行發(fā)酵，三種檢測方法檢測，所獲得的結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不相同。52%(49株)的菌株用1號培養(yǎng)基發(fā)酵，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物條帶總數(shù)最多；44%的菌株用4號培養(yǎng)基發(fā)酵條帶最多。但每一株菌產(chǎn)生最多產(chǎn)物的培養(yǎng)基各不相同。同一個菌株在不同培養(yǎng)基發(fā)酵的產(chǎn)物種類也不一樣，1號培養(yǎng)基成分最單一，便于化合物的提取、純化，且成本低廉；4號培養(yǎng)基成分比較復(fù)雜，不利于以后化合物的分離純化。所以1號培養(yǎng)基是一種比較理想的發(fā)酵培養(yǎng)基，可

HPLCchromatographyof2actinomycete

strainsat254nm以在篩選時用于大量菌株的發(fā)酵。三種檢測條件中，茴香醛檢測法獲得的總條帶最多，也可供選用。這些結(jié)果為設(shè)計適合的發(fā)酵培養(yǎng)條件、檢測方法以及活性產(chǎn)物的分離、制備奠定了基礎(chǔ)。

在微生物生物活性物質(zhì)研究中，無論TLC檢測還是HPLC檢測，和其它現(xiàn)代儀器的檢測都是可行的途徑，但特別要注意實驗條件的標(biāo)準(zhǔn)化，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，同時要建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，使數(shù)據(jù)儲存、檢索、查尋、分析程序化。

發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物是開發(fā)天然藥物的重要關(guān)鍵之一［11］，高活性菌株、新菌種提供了發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)物的可能性。要實現(xiàn)這種可能性，發(fā)酵是重要環(huán)節(jié)。過去對植物內(nèi)生菌、極端環(huán)境微生物、海洋微生物培養(yǎng)條件的研究不多，但這些微生物是很有開發(fā)潛力的資源，應(yīng)該重視這方面的研究，為發(fā)現(xiàn)新先導(dǎo)化合物提供技術(shù)支持

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