應用生物化學第一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三離心技術（centrifugaltechnique）

是根據顆粒在勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為發展起來的一種分離分析技術。第二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三一、離心技術的應用

1.用于生物、醫學、化學等實驗室分析研究的，轉速從每分鐘幾千到幾萬轉以上，此類技術的使用目的在于分離和純化樣品，以及對純化的樣品有關性能進行研究。

2.用于工業生產的，如化工、制藥、食品等工業大型制備用的離心技術，轉速都在每分鐘5000轉以下。第三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三第四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三第五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三二、離心機基本組件1.低速離心機

轉子速度控制系統最高轉速在6000rpm以下實驗室中常用于分離制備。2.高速離心機

系列轉子速度控制系統溫控系統最高轉速在25,000rpm以下常用于生物大分子的分離制備3.超速離心機系列轉子速度控制系統溫度控制真空系統常用于分離亞細胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白質分子。第六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三

轉子(Rotor)固定角式轉子(fixed-anglerotor)水平轉子(Swing-bucketrotor)垂直轉子(verticalrotor)帶狀轉子(zonalrotor)連續轉子(continuousrotor)第七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三1.固定角式轉子離心管在離心機中放置的位置與旋轉軸心形成一個固定的角度,角度變化在14-40°之間。第八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三固定角式轉子第九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三角式轉子的特點：（1）重心低,轉速可較高（2）樣品粒子穿過溶劑層的距離略大于離心管的直徑;（3）“管壁效應”：

有一定的角度,在離心過程中撞到離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉淀,此效應使最后在管底聚成的沉淀較緊密。

第十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三2.水平轉子（1）轉子靜止時,處在轉子中的離心管中心線與旋轉軸平行；（2）轉子旋轉加速時,離心管中心線由平位置逐漸過渡到垂直位置,即與旋轉軸成90°角。第十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三第十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三第十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三水平轉子的特點：

（1）轉子的重心位置較高（2）樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大于直徑（3）對于多種成分樣品分離特別有效（4）常用于速率區帶離心和等密度離心第十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三三、基本原理1.轉速

（1）rpm

RevolutionsPerMinute為每分鐘轉速（轉/分）（2）ω角速度：每秒轉過的弧度數(弧度/秒)

1弧度即為弧長等于半徑的圓弧所對的圓心角

ω＝2πrpm60第十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三2.離心力Centrifugalforce(F)

F離心力=mω2rm:質量

ω:旋轉角速度

r：旋轉體離旋轉軸的距離第十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三3.相對離心力Relativecentrifugalforce(RCF)RCF就是實際離心力轉化為重力加速度的倍數，通常用×g表示

RCF＝F離心力/F重力＝mω2r/m·g=ω2r/g

＝

1.118×10-5×(rpm)2×r半徑第十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三4.離心轉速換算公式（rpm與g）離心速度1000rpm與1000g有什么區別？（Eppendorf5415C1000g對應3066rpm）（BOECOM-241000g對應3222rpm）g（RCF）＝1.118×10-5×(rpm)2×r半徑運用離心力列線圖換算rpm與g第十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三離心力列線圖第十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三5.沉降系數

Sedimentationcoefficient(S)樣品顆粒的大小

形狀

密度

溶劑的粘度、密度

離心加速度

S=

X1:離心前粒子離旋轉軸的距離

X2:離心后粒子離旋轉軸的距離2.1×102logX2/X1rpm2(t2-t1)第二十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三6.沉降速度Sedimentationvelocity定義：指在強大離心作用下，單位時間內物質運動的距離。V=

ω2rd2(ρp-ρm)18ηd：球形粒子的直徑ρp：粒子的密度ρm：介質的密度η：流體介質的粘度數r：粒子距離心軸垂直半徑第二十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三四、離心分離方法制備型超高速離心機的幾種分離方法：A．差速離心：

速率區帶法（ratezonal）B．密度梯度離心法：

等密度離心法（isopycnic）第二十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三

A．差速離心：利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別,在同一離心條件下,沉降速度不同,通過不斷增加相對離心力,使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。差速離心的特點是操作簡單，但分離純度不高。第二十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三主要細胞成分的大小細胞核

4-12m質膜

3-20m高爾基體

1-2m線粒體

0.4-2.5m溶酶體/過氧化物酶

0.4-0.8m微粒小泡

0.05-0.3m第二十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三勻漿組織的差速離心（Ⅰ）1000g/10min去掉上清3000g/10minetc.第二十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三勻漿組織的差速離心（Ⅱ）組織勻漿

–1000gfor10min上清

from1–3000gfor10min上清

from2–15,000gfor15min上期

from3–100,000gfor45min1000g沉淀:細胞核,質膜層3000g沉淀:大線粒體,高爾基管15,000g沉淀:小線粒體,溶酶體,過氧化物酶100,000g沉淀:微粒

第二十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三差速離心（Ⅲ）固定角轉子:短沉淀路徑Fmax>Fmin水平轉子:長沉淀路徑Fmax>>>Fmin第二十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三密度屏障不連續梯度

連續梯度B、密度梯度離心第二十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三對不同粒子怎樣進行密度梯度分離?低密度高密度中等密度第二十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三ρp=ρm即

ρp-ρm=0V=0

粒子平衡

ρp>ρm

即ρp-ρm>0V>0

粒子達到某一位置后就達到平衡

ρp<ρm即ρp-ρm<0V<0

粒子逆著離心方向上浮V=

ω2rd2(ρp-ρm)18η從方程式預測

第三十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三密度梯度離心過程15234第三十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三1）速率區帶法（ratezonal）根據樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速率（S）分離。將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負梯度。由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動的速度不一樣，所以經過離心后會形成幾條分開的樣品區帶。注意：樣品粒子的密度（ρp）必須大于梯度液注中任一點的密度（ρm

）。離心過程必須在區帶到達管子底部前停止。50000rpm×15min50000rpm×20minSTOP第三十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三2）等密度離心法（isopycnic）根據粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區帶。

密度梯度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經離心后，樣品粒子達到它們的平衡點。注意：平衡后粒子的分離完全由其密度決定，與時間無關。

第三十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三123粒子密度（ρp）<最大介質密度（ρm

）

等密度離心法第三十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三不連續梯度等密度離心法的離心結果連續梯度

密度屏障III第三十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三五.

梯度溶液的制備(一).梯度材料的選擇原則:1、與被分離的生物材料不發生反應。2、可達到要求的密度范圍,且在所要求的密度范圍內,粘度低,滲透壓低,離子強度和pH變化較小。3、不會對離心設備發生腐蝕作用。4、容易純化,價格便宜或容易回收。5、濃度便于測定,如具有折光率。第三十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三（二）常用的梯度材料：

糖類:

蔗糖、甘油、聚蔗糖、右旋糖酐、糖原無機鹽類:CsCl(氯化銫)、RbCl(氯化銣)、NaCl、KBr等有機碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等硅溶膠:

Percoll。蛋白質:牛血清白蛋白非水溶性有機物:氟代碳等第三十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三(三).梯度材料的應用范圍

1.蔗糖:

水溶性大，性質穩定，滲透壓較高，最高密度可達1.33g/ml,價格低，容易制備。常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料制備有較大的滲透壓,不宜用于細胞的分離。第三十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三2.聚蔗糖:

商品名Ficoll,滲透壓低，粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。用于分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞

第三十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三

3.氯化銫:

離子性介質，水溶性大，最高密度可達1.91g/ml重金屬鹽類,在離心時形成的梯度有較好的分辨率。被廣泛地用于DNA、質粒、病毒和脂蛋白的分離，價格較貴。第四十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期三

4.鹵化鹽類:

Br和NaCl可用于脂蛋白分離KI和NaI可用于RNA分離,其分辨率高于銫鹽NaCl梯度可用于分離脂蛋白NaI梯度