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文檔簡介

Real-timePCRPCR發展歷程第一代PCR——終點PCR第二代PCR——實時PCR（Real-timePCR）第三代PCR——數字PCR（DigitalPCR）實時熒光PCR的基本原理通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量（標準曲線）及定性的分析。PCR動力學曲線和四個階段三個重要的概念基線（Baseline)閾值(Threshold)Ct基線（Baseline)是背景曲線的一段，從反應開始不久熒光值開始變得穩定，直到所有反應管的熒光都將要，但是還未超出背景。閾值(Threshold)

閾值（threshold）：熒光超過本底時的臨界數值。熒光域值的默認設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍手動設置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要保證在指數增長期。Ct值Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數C(t)valuePCR擴增的數學模型熒光定量PCR技術的主要優點各種熒光PCR儀器Real-timePCR過程檢測模式SYBRGreenⅠ水解探針

①

Taqman探針（最常見）

②

TaqmanMGB探針（凱普）雜交探針①分子信標（MolecularBeacon）

②雙雜交探針（FRET探針）

SYBRGreenⅠSYBRGreen染料法的特點Taqman探針TaqmanMGB探針HPVReal-timePCR產品主要廠家復星科華上海之江達安凱普凱杰港龍羅氏復星科華上海之江達安凱普凱杰港龍雅培市場主要熒光PCRHPV檢測產品熒光PCR產品13高危HPV凱普SFDA港龍SFDA上海之江生物SFDA12+2高危HPV凱普SFDA羅氏FDA、SFDA雅培無凱普12+2High-riskHPV適用的主要熒光PCR儀：LineGene9660、ABI7500、Rotor-Gene6000、Mx3005P、LightCycler480、ABIViiA7PCR中常見問題分析標本的采集與儲存標本的制備——核酸純化試劑準備、加樣擴增、檢測結果分析報告解釋標本的采集與儲存1、標本的采集嚴格按照要求采樣，盡可能減少粘液和血液，采集到盡可能多的宮頸脫落細胞標本的采集與儲存2、儲存條件①提取前的原始標本一周內提取4℃一周后提取-20℃②提取后的HPVDNA

檢測前一周內檢測4℃一周后檢測-20℃檢測后-20℃標本的制備——核酸純化原理：煮沸法：表面活性劑（如TritonX-100、SDS等）＋煮沸1、優點簡單、快捷、方便2、缺點

HPVDNA純度較差，含有血紅素、蛋白、脂類等PCR抑制劑。試劑準備、加樣1、試劑配制的均一性、分裝的均一性2、常用試劑的分裝和儲存-20℃，避免反復凍融3、加樣的準確性和重復性擴增、檢測影響因素：引物、探針、儀器設備狀態陽性對照——監控系統故障陰性對照——監控污染結果分析ABI儀器1、設置基線：2、設置閾值線：基線和陰性對照的上方，同時保證在指數增長期。結果分析1、整體擴增曲線的觀察2、

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