細菌培養基的制備滅菌及接種培養技術詳解演示文稿1當前第1頁\共有33頁\編于星期四\7點優選細菌培養基的制備滅菌及接種培養技術2當前第2頁\共有33頁\編于星期四\7點目的要求熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備。掌握培養基和無菌水的制備方法。掌握高壓蒸氣滅菌技術。3當前第3頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗材料藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水等。高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱、細菌過濾器、酒精燈。其它：培養皿、試管、移液管、錐形瓶、燒杯、玻璃珠等。4當前第4頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序玻璃器皿的洗滌和包裝培養基的制備無菌稀釋水的制備培養基和玻璃器材等的滅菌5當前第5頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1（玻璃器皿的洗滌和包裝）清洗并烘干玻璃器皿：如培養皿、移液管、試管等。棉塞的制作包裝培養皿和移液管等。

6當前第6頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序2

（培養基的種類）據組成成分可分為:

1.合成培養基：由各種純化學物質按一定比例配制而成。2.半合成培養基：有一部分純化學物質和另一部分天然物質配制而成。3.天然培養基：利用天然來源的有機物配制而成。從培養基的物理狀態可分為1.液體培養基：不加凝固劑的液體狀態培養基。2.固體培養基：在液體培養基中加入15～30g/L左右的瓊脂。3.半固體培養基：在液體培養基中加入3～5g/L左右的瓊脂。7當前第7頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序2

（培養基的種類）常用凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。8當前第8頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序2

（培養基的配制方法和步驟）1.取一個300mL燒杯，裝150mL蒸餾水。2.按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。注意：a.前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分b.可加熱促進各成分溶解c.加熱過程應不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當補充因蒸發而損失的水量。培養基配方牛肉膏蛋白胨氯化鈉瓊脂蒸餾水pH數量0.75g1.5g0.75g3g150mL7.69當前第9頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序2

（培養基的配制方法和步驟）3.調pH值：用10％NaOH調pH至7.6，用精密pH試紙對照。4.分裝：將培養基分裝于5支試管，其余全部倒入250mL錐形瓶中，分別塞上棉塞。注意不要污染棉塞和瓶口。5.包扎成捆，掛上標簽，注明何種培養基。6.滅菌備用：培養基滅菌后必須在37℃下恒溫培養24h，確定無菌生長，方可使用。10當前第10頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序2（培養基的分裝和斜面培養基的制作）☆每支試管裝的量為試管高度的1/4～1/3.☆斜面長度為試管長度的1/3～1/2.11當前第11頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序2（培養基的配制方法和步驟）12當前第12頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序3

（無菌稀釋水的制備）取一個250mL的錐形瓶裝90(或99)mL蒸餾水，放30顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶內，塞棉塞、包扎，待滅菌。另取5支18mm×180mm的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。無菌稀釋水為微生物分離實驗中所需要的材料。13當前第13頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序4

（培養基和玻璃器材等的滅菌）加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅菌的操作方法a.將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調節至160℃并維持2h；b.把恒溫箱的調節旋鈕調回零處，待溫度降到50℃左右，才能將物品取出。14當前第14頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序4

（培養基和玻璃器材等的滅菌）濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下：1.滅菌鍋內加入一定量的水。2.將待滅菌的物品放入鍋內，并關嚴鍋蓋。

注意：器物不能裝得太滿。3.接通電源，進行加熱。4.排除高壓鍋內的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計指示溫度為100℃時關閉排氣閥；或當排出的蒸氣相當猛烈且微帶藍色時關閉排氣閥。15當前第15頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序4

（培養基和玻璃器材等的滅菌）5.當壓力達1.05kg/cm2(滅菌器內的溫度為121℃)即開始滅菌，使其維持15～30min。對熱不穩定的培養基如含有葡萄糖、氨基酸等物質時，應適當降低壓力(0.56kg/cm2)，延長時間。6.滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內剩余水。7.待培養基冷卻后置于37℃恒溫箱內培養24h，若無菌生長則放入冰箱或陰涼處保存備用。16當前第16頁\共有33頁\編于星期四\7點17當前第17頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序4（培養基和玻璃器材的滅菌方法）間歇滅菌法：即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養基的滅菌。操作方法：a.待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次在100℃煮沸30～60min，連續3d重復進行。b.在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養基）放在37℃恒溫條件下培養24h，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發成營養體，以便下次蒸煮時殺滅。c.第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要放在37℃恒溫條件下培養24h，確定無菌才能使用。18當前第18頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序4

（培養基和玻璃器材的滅菌方法）過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質（如維生素、血清），一般可用細菌過濾器進行除菌。19當前第19頁\共有33頁\編于星期四\7點第二部分

細菌純種分離、培養和接種技術目的要求實驗材料實驗程序20當前第20頁\共有33頁\編于星期四\7點目的要求掌握從環境中分離培養細菌的方法，從而獲得若干種細菌純培養技能。掌握幾種接種技術。21當前第21頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗材料無菌培養皿(直徑90mm)10套、無菌移液管1mL2支、10mL1支。營養瓊脂培養基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，無菌稀釋水90mL1瓶、9mL5管。其它：接種環、酒精燈、恒溫箱。22當前第22頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序細菌的純種分離細菌的接種方法23當前第23頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1（細菌的純種分離）稀釋平板法平板劃線法24當前第24頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1

（細菌的純種分離——稀釋平板法）1.

取樣。

2.將1瓶90mL和5管9mL無菌水排列好，用記號筆依次編上10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL水樣(或其它樣品)加入編號為10－1無菌水(內含玻璃珠)中，將移液管吹洗三次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散。即為10－1濃度的菌液。用1mL無菌移液管吸取1mL10－1濃度的菌液于編號為10－2無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為10－2濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10－6。25當前第25頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1

（細菌的純種分離——稀釋平板法）稀釋液的制備26當前第26頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1

（細菌的純種分離——稀釋平板法）3.

平板的制作①取10套無菌培養皿編號，10－4、10－5、10－6各3個，另一個為空氣對照。②取1支1mL無菌移液管從濃度小的菌液開始，以10－6、10－5、10－4為序分別吸取0.5mL菌液于相應編號的培養皿內(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。27當前第27頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1

（細菌的純種分離——稀釋平板法）3.

平板的制作③加熱培養基，當其冷至45℃左右時，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手拿培養皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養基后將培養皿平放在桌上，順時針和逆時針來回轉動培養皿，使培養基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30℃培養24～48h，然后觀察結果。28當前第28頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1

（細菌的純種分離——稀釋平板法）3.

平板的制作④取對照無菌培養皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上，倒置于30℃培養24～48h，然后觀察結果。29當前第29頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1

（細菌的純種分離——平板劃線法）1.平板制作：將融化并冷至約50℃的肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒入無菌培養皿內，使凝固成平板。2.劃線：用接種環挑取一環樣品，左手拿培養皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環伸入培養皿內，在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養基)。劃線完畢蓋好皿蓋，30℃培養24～48h后觀察結果。30當前第30頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序1

（細菌的純種分離——平板劃線法）31當前第31頁\共有33頁\編于星期四\7點實驗程序2

（細菌的接種技術）接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。圖－632當前第32頁\