淺論互補式親和層析純化制備兔源性抗人精子多克隆抗體標準品【摘要】目的：純化制備兔源性抗人精子多克隆抗體標準品。方法：利用人精子抗原及其他組織蛋白等分別制備親和層析柱，經(jīng)正反相互補式親和層析從兔抗血清中純化IgG和IgA型抗人精子多克隆抗體，用SDSPAGE、Westernblot和ELISA等法檢測其純度、特異性和與精子抗原的線性反應(yīng)。結(jié)果：所得抗體與牛血清白蛋白、正常人全血清、正常人組織細胞裂解液等在診斷試劑中常有的物質(zhì)無可見交叉反應(yīng)，在～2ng·ml-1或～·ml-1濃度范圍內(nèi)與精子抗原的酶聯(lián)吸附試驗呈直線反應(yīng)。結(jié)論：該純化方案可用于抗精子抗體定量檢測中抗體標準品的制備。

【關(guān)鍵詞】抗精子抗體定量酶聯(lián)免疫吸附試驗親和層析

Abstract：ObjectiveTopreparepurifiedrabbitantihumanspermpolyclonalantibodystandard.MethodsThreetypeofaffinitychromatographycolumnrespectivelymadefromhumanspermantigen,normalserumandlysateofnormaltissuecellswereusedtopurifytheantispermpolyclonalantibody(IgGandIgA)fromrabbitantihumanspermresultingantibodywasfurtherappliedtoSDSPAGE,westernblotandenzymelinkedimmunoabsorbentassay(ELISA)fordeterminingitspurity,specificityandlinearreactionwithspermantigen.ResultsThepurifiedantispermantibodyshowsnodetectablecrossreactioninwesternblotwithBSA,humanserum,lysateofhumannormaltissuecellswhichusuallyexistedinimmunodiagnostictheconcentrationrangeof–·ml－１(forIgGisotype)or–·ml－１(forIgAisotype),thepurifiedantibodyreactedinELISAwithspermantigeninalinearmanner.ConclusionThepurificationscheduleisfeasibleforpreparationofantibodystandardusedinantibodyquantitativedetection.

Keywords：antispermantibody；quantitativeenzymelabeledimmunosorbentassay；affinitychromatography

我國不孕育癥發(fā)生率占已婚夫婦的8%～15%，近20%為免疫性不孕育，其中抗精子抗體的重要致病作用已被大量實驗和臨床觀察所證實［15］。存在于男女血清、精漿及宮頸分泌液中的抗精子抗體的濃度高低直接決定著其抗生育效應(yīng)的強弱，也是療效觀察和預(yù)后判斷的有效量化指標。因此，抗精子抗體的定量檢測對診斷和治療免疫性不孕育非常重要。然而，由于精子抗原種類繁多，抗精子抗體標準品不易獲得，目前我國尚無廠家生產(chǎn)抗精子抗體定量檢測試劑盒。大多數(shù)醫(yī)院采用酶標法或金標法試劑盒進行抗精子抗體的定性檢測，極少數(shù)醫(yī)院采用昂貴的進口試劑盒進行定量分析［611］。但是這些進口定量試劑盒實際上仍屬于半定量的性質(zhì)，他們都只能以U·ml－1來表示所測抗精子抗體的濃度，而并不能準確說明一個U代表多少質(zhì)量的抗精子抗體，而且每家公司各自定義其標準品中抗精子抗體的單位數(shù)，互不可比。本研究首次利用高純度人精子膜抗原等多種蛋白制劑制備互補式親和層析柱，從經(jīng)人精子免疫的兔血清中提取純化出純度高、與正常人血清蛋白和組織細胞裂解液無交叉反應(yīng)的高特異性抗人精子多克隆抗體標準品，為進一步純化人源性抗人精子多克隆抗體標準品奠定了基礎(chǔ)，有利于我國抗精子抗體定量檢測方法的建立。有關(guān)純化方案已申請國家發(fā)明專利。

1材料與方法

免疫接種及人精子膜抗原的提取純化

取精液常規(guī)檢查為正常的人精液標本200ml，經(jīng)mol·L-1pHPBS離心洗滌3次，用生理鹽水制成精子懸液后常規(guī)免疫家兔3次，皮下多點注射，每次1×106，每次接種間隔2周。末次免疫后2周心臟取血，分離兔血清，分裝后置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

人精子膜抗原采用超聲波粉碎、NP40萃取與3種互補式親和層析柱(A、B、C柱)相結(jié)合的新提純方案而得，經(jīng)與兩種市售ELISA試劑盒比較，陰陽性符合率達100%，且與正常人血清標本無反應(yīng)，OD值≤［12］。

主要試劑

CNBr活化的SepharoseCL4B、HRP、TMB、DAB，DEAE52纖維素、SephadexG200，BCA蛋白定量試劑盒，PVDF膜，HRP標記的羊抗兔IgG和羊抗兔IgA，牛血清白蛋白Ⅴ、小牛血清。

兔血清中總IgG和總IgA的提取純化［13］

總IgG提取純化:取免疫兔血清,經(jīng)常規(guī)33%硫酸銨鹽析法粗提IgG型免疫球蛋白,透析除鹽后再分批過DEAE52纖維素層析柱，用mol·L-1pHPBS洗脫，收集洗脫液，經(jīng)聚乙二醇濃縮至2～4mg·ml-1(BCA法蛋白定量)即為精制總IgG，分裝置-70℃保存?zhèn)溆谩Ｋ宣}析、透析、層析及離心步驟均在4℃進行，且下同。總IgA提取：取免疫兔血清加等量mol·L-1ZnSO4液，調(diào)pH至，攪拌1h后離心去沉淀，上清中加等量飽和硫酸銨，混勻后4℃過夜，離心去上清后溶沉淀于10%EDTANa中，透析除鹽后再分批過DEAE52纖維素層析柱，先用mol·L-1PBS洗脫并棄洗脫液，再換用mol·L-1pHPBS洗脫，所收集蛋白峰即為IgA。聚乙二醇濃縮后再過SephadexG200柱，經(jīng)mol·L-1pHPBS洗脫,第一蛋白峰即為精制總IgA，BCA法蛋白定量后分裝置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

親和層析柱的制備與抗精子抗體的純化

以下純化方案已申請國家發(fā)明專利：將純化的人精子抗原2mg及其他兩種組織蛋白各20ml,分別與溴化氰活化的SepharoseCL4B偶聯(lián)成親和層析D、E和F柱［14］。取從免疫兔血清中提取純化的總IgG或總IgA，分批過D柱，按常規(guī)［14］層析，收集與層析柱相結(jié)合的蛋白，并立即調(diào)整酸性收集液的pH值至。將多批層析所得的收集液合并濃縮后再過E柱，收集不與層析柱結(jié)合的蛋白,再過F柱，收集不與層析柱結(jié)合的蛋白。聚乙二醇濃縮后經(jīng)mol·L-1pHPBS透析過夜即得精制的抗人精子抗體IgG標準品或IgA標準品。BCA法蛋白定量后加適量甘油，分裝置-70℃保存。

抗精子抗體的純度鑒定

常規(guī)制備10%SDS聚丙烯酰胺凝膠板。取BSAⅤ、人全血清、人組織細胞裂解液、純化的人精子膜抗原和未加甘油的抗精子抗體IgG或IgA純品,分別加入等量的2×樣品緩沖液后煮沸10min，離心后取上清20μl上樣。連接BioRAD200型電泳儀后于80V電泳1～2h，經(jīng)考馬斯亮蘭R250染色1h后脫色過夜。

抗精子抗體的特異性分析

將800μg辣根過氧化物酶(HRP)溶于200μl含200μg抗精子抗體IgG或IgA純品的PBS中,緩慢加入1%戊二醛溶液800μl，室溫反應(yīng)后于4℃經(jīng)PBS透析48h除去游離的戊二醛，置4℃?zhèn)溆谩Ｈ∪私M織細胞裂解液、BSAⅤ、未婚少女血清和純化的人精子膜抗原進行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)BioRADTransBlotSD型半干轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)于PVDF膜上，用2%BSA5%脫脂奶粉PBS溶液于4℃封閉PVDF膜過夜。取HRP標記的抗精子抗體IgG或IgA溶液與膜雜交，用含%吐溫20的PBS充分洗膜后加DAB底物顯色1min。

定量酶聯(lián)免疫吸附實驗(定量ELISA)

在酶標條板中加入5mmol·L-1戊二醛溶液每孔ml，37℃反應(yīng)4h，用mol·L-1pHPBS洗滌4次后自然晾干。將純化的精子膜抗原用pH的碳酸鹽溶液稀釋成1～8μg·ml-1，加入上述條板，4℃包被過夜。2%BSAPBS室溫封閉條板2h后用含%吐溫20的PBS洗滌3次，加入倍比稀釋于1%BSAPBS中的抗精子抗體IgG或IgA純品，室溫反應(yīng)1h，同上洗滌后加入HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗兔IgA，室溫30min后洗滌3次，加TMB底物溶液顯色10min，mol·L-1硫酸終止顯色后于450nm處測吸光值。另外用少女全血清、人組織細胞裂解液和BSA等液分別包被酶標條板，同上封閉后與純化的抗精子抗體反應(yīng)，檢測可能存在的非特異性結(jié)合或者說ELISA的背景噪音。

2結(jié)果

抗精子抗體的純度分析

將純化的抗精子抗體IgG型(圖1)和IgA型(圖2)蛋白液跑10%SDSPAGE變性電泳,只在相對分子質(zhì)量為55000和25000的位置各出現(xiàn)1條主要條帶,即抗體的重鏈和輕鏈。同時人全血清、BSAⅤ及人組織細胞裂解液則顯示眾多蛋白條帶。純化的人精子抗原因相對分子質(zhì)量大小不一且混有甘油保護劑，除1條主帶呈弧形外尚有彌散分布的小分子蛋白區(qū)。

抗精子抗體的特異性分析

在免疫印跡實驗中,HRP標記的抗精子抗體僅與純化的精子膜抗原雜交,呈現(xiàn)1條主帶和多條弱帶,且其位置與精子膜抗原在SDSPAGE中的位置一致。而與人組織細胞裂解液、少女全血清及BSAⅤ等無任何可見的雜交帶，顯示純化的IgG型和IgA型抗精子抗體與正常組織細胞蛋白和正常血清蛋白的交叉反應(yīng)很弱。

抗精子抗體與精子抗原的酶聯(lián)免疫反應(yīng)

將純化的精子抗原分別以1、2、4、8μg·ml-1的濃度包板后，與倍比稀釋的抗精子抗體作間接ELISA，結(jié)果顯示：在４種抗原包被濃度下，IgG型抗精子抗體在抗體的純度～2ng·ml-1的濃度范圍時,OD值呈直線性,最低可測濃度為2ng·ml-1，其OD值如圖4A；IgA型抗精子抗體在～ng·ml-1范圍時,OD值顯直線性,最低可測濃度為ng·ml-1，其OD值如圖4B。OD值的高低與抗精子抗體的濃度成明顯劑量依賴關(guān)系，而對抗原包被濃度的依賴性不明顯。在少女全血清、人組織細胞裂解液或BSAⅤ等液體包板時，抗精子抗體基本無結(jié)合反應(yīng)，OD值與調(diào)零孔相似。

3討論

與任何定量酶聯(lián)免疫吸附實驗一樣，抗精子抗體的定量分析應(yīng)該有抗精子抗體的標準品。但是人類精子抗原可能多達數(shù)百種，而且大多數(shù)未能進行基因確定和克隆表達，因此無法利用重組蛋白獲得如此眾多的單克隆或多克隆抗體。不同抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，其親和力差異很大，即使能獲得少數(shù)幾種重組精子抗原，其相對應(yīng)的單克隆或多克隆抗體與精子抗原的結(jié)合能力未必能代表針對幾百種精子抗原的抗體的親和力。這種親和力差異將直接導(dǎo)致定量檢測結(jié)果的不同。另外，鼠源性或兔源性抗體因親和力的差異也不適于用作標準品定量分析人源性抗體，因此，利用人類精子抗原的混合物從眾多患者血清中純化的人源性抗人精子多克隆抗體，更能體現(xiàn)患者體內(nèi)抗精子抗體的多樣性和其各不相同的與抗原分子的親和力。

如何制備對應(yīng)的精子抗原種類多而同時又擁有高度特異性的抗精子抗體一直是準確檢測抗精子抗體的難點問題。本研究利用來自眾多健康個體的完整的精子細胞混懸液多次免疫實驗兔，從免疫的兔血清和其他兔血清中分別提取IgG蛋白，制作成親和層析A柱和B柱。前者包含抗精子抗體IgG和非抗精子抗體IgG，后者全部為非抗精子抗體IgG，且與前者所含的非抗精子抗體IgG成分相同。與A柱結(jié)合的蛋白中除含人精子抗原外尚有能與兔源非抗精子抗體IgG結(jié)合的未知人源蛋白，因此需繼續(xù)過B柱，去除這些與非抗精子抗體IgG結(jié)合的成分。這種互補式親和層析的新方案在理論上保證了所提取精子抗原的高純度。我們先前提取精子抗原的研究結(jié)果也證明了這一點［12］。利用該精子抗原制作親和層析柱，進一步純化免疫兔血清中的抗精子抗體，并利用其他兩種組織蛋白層析柱去除所純化抗精子抗體中能與正常人血清反應(yīng)的成分。免疫印跡實驗和ELISA分析均證實，所得的抗精子抗體不與正常人血清、正常人組織細胞裂解液及牛血清白蛋白等可能出現(xiàn)在ELISA檢測系統(tǒng)中的成分發(fā)生反應(yīng)，為其成為定量分析中的抗體標準品奠定了基礎(chǔ)。

值得注意的是，鼠源性或兔源性抗體因親和力的差異也不完全適于用作標準品定量分析人源性抗體。利用人類精子抗原的混合物從眾多患者血清中純化的人源性抗人精子多克隆抗體更能體現(xiàn)患者體內(nèi)抗精子抗體的多樣性和其各不相同的與抗原分子的親和力。本研究為此奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

另外，目前尚無商家使用純化的抗精子抗體作為標準品進行定量分析。如果使用純化的抗精子抗體作為標準品對臨床標本進行定量分析，則應(yīng)先利用自制的抗體標準品確定人群中抗精子抗體的正常值范圍，其中已婚生育的男性人群和女性人群的抗精子抗體水平以及基于正常值范圍的陽性預(yù)測值對臨床檢測結(jié)果的評價尤為重要。

【參考文獻】

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