2試驗(yàn)操作指南》名目植物基因序列分析 3引物設(shè)計(jì)的原則 4\l“_TOC_250008“試劑的配置和滅菌 5\l“_TOC_250007“植物基因組DNA的提取 6\l“_TOC_250006“DNA的定量 8\l“_TOC_250005“DNA的電泳 9\l“_TOC_250004“PCR產(chǎn)物的回收 12\l“_TOC_250003“PCR產(chǎn)物連接T載體和感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 14\l“_TOC_250002“菌落〔液〕PCR 17\l“_TOC_250001“質(zhì)粒DNA的提取 19\l“_TOC_250000“質(zhì)粒DNA的酶切 211植物基因序列分析1植物基因序列分析3基因組DN〔genomicDNA,gDN：功能基因包括三個(gè)根本序列5上游區(qū)，轉(zhuǎn)3’下游區(qū)。5’上游區(qū)和3’下游區(qū)：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游的序列，主要起到基因表達(dá)調(diào)控作用。RNA最終被加工為成mRNA。信使RN〔messengerRNA,mRN由DNA遺傳信息的能指導(dǎo)蛋白合成的一類單鏈核糖核酸。由編碼區(qū)、上游的5’非編碼區(qū)和下游3’非編碼區(qū)組成，5’7-甲基鳥苷-三磷酸帽子構(gòu)造，3’端有多腺苷酸尾巴。互補(bǔ)DN〔complementaryDNA,cDNA具有與某mRNADNA。蛋白質(zhì)編碼區(qū)〔sequencecodingforaminoacidsinprotein,CDS〕：與蛋白質(zhì)序列一一對(duì)應(yīng)的DNA序列，且該序列中間不含其它非該蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的序列。只有外顯子，不含內(nèi)含子。’非翻譯區(qū)5untranslatedregion,5’UTmRNA位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至編碼區(qū)翻譯起始密碼子之間挨次。3’〔3-untranslatedregion,’UTmRNA段不被翻譯的序列。2引物設(shè)計(jì)的原則2引物設(shè)計(jì)的原則420-25bp500bp16-18bp的引物；5kb，則需要用更長的引物。加有酶切位點(diǎn)的引物可適當(dāng)延長。引物的特異性：最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)好后需要通過序列比對(duì)判別其特異性。引物GC含量：GC40%－60%45-55%為宜。引物Tm：TmDNADNATm7255-80Tm=2(A+T)+4(C+G)引物序列隨機(jī)性：ATGC5個(gè)以上嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物自身：不能含有很長的結(jié)實(shí)的自身互補(bǔ)序列，尤其是引物3‘引物自身：不能含有很長的結(jié)實(shí)的自身互補(bǔ)序列，尤其是引物3‘端回折形成的發(fā)夾一3bp。引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有很長的結(jié)實(shí)的互補(bǔ)或同源堿基，尤應(yīng)避開3’引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有很長的結(jié)實(shí)的互補(bǔ)或同源堿基，尤應(yīng)避開3’端的互補(bǔ)重疊。重疊。3’3’末端和模板的堿基完全配對(duì)；防止發(fā)夾構(gòu)造和二聚體形成。引物的5′端：引物的5′端可以修飾，加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列。53試劑的配置和滅菌一、試劑的配置：利用電子天平稱取固體試劑或者量筒〔或移液器〕量取液體試劑溶于適量的溶劑。如需調(diào)整pH值，需要pH計(jì)的測(cè)定下用酸或堿滴定至目標(biāo)pH。試劑配置的原則是先配置濃度高的各組分溶液，然后再將各組分溶液混合獲得各種緩沖溶液和試劑的貯存液，滅菌后低溫保存，需要時(shí)再稀釋到工作液濃度使用。二、試劑和耗材的高壓蒸汽滅菌：在高溫高壓條件下，利用濕熱使細(xì)菌、真菌、芽孢、孢子等微生物的蛋白變性，進(jìn)而死亡到達(dá)滅菌的效果。主要適用于耐高溫、高壓，不怕潮濕的試劑與耗材。預(yù)備：向高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)加水至水位標(biāo)記線，將預(yù)備滅菌的試劑及耗材用牛皮紙包好，裝入鍋內(nèi)套層中〔物品放置不宜過多，鍋內(nèi)應(yīng)留出確定空間；然后擰緊鍋蓋。加熱：加熱，當(dāng)壓力表上升到所需壓力時(shí)〔一般為100KPa/12℃，滅菌15-30mi。完畢：待壓力表降至“0”時(shí)，翻開鍋蓋，取出滅菌物品。留意事項(xiàng)：嚴(yán)格遵照操作規(guī)程，防止意外事故發(fā)生；易燃，易爆物品禁用高壓蒸氣滅菌；瓶裝液體滅菌時(shí)，應(yīng)留有適當(dāng)排氣出口，滅菌完畢后再密閉；耗材滅菌完畢后最菌；瓶裝液體滅菌時(shí)，應(yīng)留有適當(dāng)排氣出口，滅菌完畢后再密閉；耗材滅菌完畢后最好烘干。三、試劑的過濾滅菌：承受過濾法除去微生物，適合于對(duì)熱不穩(wěn)定的試劑。將待過濾溶液吸入注射器，通過壓力使溶液經(jīng)過過濾器〔內(nèi)含孔徑為0.22-0.4m的過濾膜〕進(jìn)入無菌容器。104DNA的提取一、試驗(yàn)?zāi)康模喝コ鞍踪|(zhì)、RNA等高分子物質(zhì)，去除多糖、多酚等次生物質(zhì)，獲得高品質(zhì)的植物基因組DNA，可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等試驗(yàn)。二、試驗(yàn)原理：十六烷基三甲基溴化胺〔cetyltriethylammoniumbromide,CTAB〕是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中>0.7MCTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后參與異丙醇或乙醇沉淀即可使核酸分別出來。三、試驗(yàn)試劑：2%CTAB提取緩沖液：2%〔w/〕CTA100mMTris-C〔pH8.，20mMEDTpH8.，1.4MNaCl1MTris-C〔pH8.：121.1gTris1L800mlddH2O充分溶解，參與濃鹽酸調(diào)整至pH8.01L。留意：pH以定容和溶液冷卻至室溫時(shí)為準(zhǔn)。3. 186.1gEDTA-Na?2HO1L800mlddHONaOH2 2 2調(diào)整至pH8.01L。留意：pH以定容和溶液冷卻至室溫時(shí)為準(zhǔn)。4. 氯仿/異戊醇〔24:1,v/v〕5. 無水乙醇6. 75%乙醇7. ddH2O四、試驗(yàn)步驟：2%CATB60℃水浴溶解。取1-2500l2%CATB提取緩沖液。6530min10min輕輕搖動(dòng)混勻。2min后，參與等體積氯仿-異戊醇，猛烈震蕩。10,000rpm10min。2-2.5倍體積無水乙醇，緩慢上下?lián)u動(dòng)30s混勻。10,000rpm10min，棄盡上清，保存沉淀。70%乙醇清洗沉淀兩次。室溫下空氣晾干沉淀。30-50μlddH2O，定量并電泳檢測(cè)。五、留意事項(xiàng)：為保證DNA分子的完整性，操作過程中動(dòng)作要輕柔。2%CTAB提取緩沖液在低于15預(yù)熱。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，防止反復(fù)凍融。附Trizol法提取RNA的流程〔演示：向~100mg1mlTrizol〔Invitrogen〕試劑并重懸。13,000rpm10min，將上清轉(zhuǎn)移到的RNase-free的離心管中。200μl氯仿，充分混勻。13,000rpm10min400μl左右的上清轉(zhuǎn)移到的離心管中。400μl異丙醇，-2010min，沉淀RNA。4℃，13,000rpm10min，棄上清。1ml75%的乙醇，潤洗沉淀。13,000rpm5min，棄上清，并吸去殘留液體。5-10min，使乙醇揮發(fā)干凈。50μlRNase-freeddH2O溶解并測(cè)定濃度與純度。DNA的定量一、試驗(yàn)?zāi)康模簷z測(cè)DNA的濃度和純度，為后續(xù)DNA分析試驗(yàn)供給依據(jù)。二、試驗(yàn)原理：DNA260nm處。當(dāng)OD260＝1時(shí)，dsDNA50μg/ml，ssDNA37μg/ml30μg/ml。當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。一般狀況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的OD260、OD280，計(jì)算其比值來衡量樣品的純度。純DNA：OD260/OD280≈1.8〔＞1.9RNA污染；＜1.6，說明有蛋白質(zhì)、酚等污染。三、試驗(yàn)試劑：DNA樣品ddH2O緩沖液四、試驗(yàn)步驟：10min。ddH2O洗滌比色皿，吸水紙吸干。參與溶解樣品的緩沖液后，調(diào)零。將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋后，分別測(cè)定260nm280nm波長時(shí)的OD值。計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度。DNA樣品純度：OD260/OD280。DNA樣品的濃度〔μg/μl〕=OD260×稀×50/1000注：取樣量和稀釋倍數(shù)由比色皿或儀器類型確定。30μlDNA3mlddH2O；2μlDNA100μlddH2O；Nano-drop2μlDNA溶液直接測(cè)定。DNA的電泳一、試驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)和把握瓊脂糖電泳法鑒定DNA的原理和方法。二、試驗(yàn)原理：瓊脂糖凝膠電泳是用于分別、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取DNA在堿性條件下〔pH8.0〕帶負(fù)電荷，在電場中通過凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)。不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在GoldView〔EB〕電泳檢測(cè)DNA時(shí)，GoldView與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)。三、試驗(yàn)試劑：加樣緩沖液0.25%溴酚藍(lán)，40%〔w/v〕蔗糖TAE電泳緩沖液儲(chǔ)存液50，1242gTris堿，57.1ml100ml0.5MEDTpH8.〕工作液1：40mMTris1mMEDTpH8.〕Goldview核酸染料基因組DNA或質(zhì)粒DNA等四、試驗(yàn)步驟：將有機(jī)玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，開口封好，放在水平的工作臺(tái)上，插上樣品梳。取適量瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中〔1-25KbDNA1%的凝膠，20-100Kb的DNA用0.5200-2023bp的DNA用1.5的凝膠至完全溶化。將Goldview60〔1l每100ml瓊脂糖凝膠。待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)參與電泳緩沖液，然后拔出梳子。將DNA樣次序和加樣量。安裝電極導(dǎo)線，點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極，翻開電源，調(diào)整電壓，進(jìn)展電泳。電泳完畢后，取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)展觀看和記錄。目的基因的PCR擴(kuò)增一、試驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)和把握聚合酶鏈?zhǔn)椒错懙母驹砗蛻?yīng)用。二、試驗(yàn)原理：二、試驗(yàn)原理：PCR反響由變性--退火--延長三個(gè)根本反響步驟構(gòu)成：DNA95℃左右確定時(shí)間后，使模板DNAPCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反響作預(yù)備。退火：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。三、試驗(yàn)試劑：延長：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反響原料，靶序DNA鏈互補(bǔ)的半保存復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延長三過程，就可獲得更多的“半保存復(fù)制鏈”，而且這種鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。三、試驗(yàn)試劑：Taq〔TaKaRaLATaq〕dNTPMixture〔TaKaRa〕引物基因組DNAddH2O四、試驗(yàn)步驟：四、試驗(yàn)步驟：合成的引物在離心機(jī)中短暫離心后溶于適量ddH2O100μM的儲(chǔ)存液，放置于-2010μM的工作液。在微量離心管中配置以下PCR體系并混勻試劑使用量〔μl〕使用量〔μl〕植物DNA12LATaq0.21dNTP14I0.52IIPCRbuffer〔5x〕ddH2O0.5314.8210放置于PCR儀中按以下程序運(yùn)行：94℃5min；94℃30sec，55℃1min，72℃1min，30cycle；72℃5min；16℃保溫。取出PCR產(chǎn)物，電泳檢測(cè)。五、留意事項(xiàng)：五、留意事項(xiàng)：引物設(shè)計(jì)需合理。退火溫度需適宜，必要時(shí)可結(jié)合梯度PCR儀使用。PCR產(chǎn)物的回收

〔參照博邁德多功能DNA純化回收試劑盒〕獲得高質(zhì)量DN；除去蛋白〔如酶等RN，無機(jī)鹽NaCl超過150mM對(duì)T4有抑制作用，小于100bp的短片段〔如引物DN，有機(jī)小分子〔如dNTP等。二、試驗(yàn)原理：在高離序鹽存在的狀況下，DNA列快速的漂洗－離心的步驟，使用去蛋白液和漂洗液將引物、核苷酸、蛋白酶等雜質(zhì)去除，最終使用低鹽和高pH值的洗脫緩沖液將純潔DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。三、試劑盒組成：溶膠/結(jié)合液漂洗液洗脫液吸附柱收集管四、操作步驟〔瓊脂糖凝膠回收：在長波紫外燈下，用干凈刀片將所需回收的DNA條帶切下，盡量切除不含DNA的凝膠，得到凝膠體積越小越好。DNA1.5ml1.5ml離心管重量，然后放入凝膠塊后再稱一次，兩次重量相減，得到凝膠的重量。3倍體積溶膠/結(jié)合液DB〔100mg300μl溶膠液〕。26倍體積溶膠液。5610min〔或直至膠完全溶解2-3min渦旋震蕩一次幫助加速溶解。將上一步所得溶液參與吸附柱EC〔吸附柱放入收集管中1mi12,000rpm離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液。參與500μl漂洗液WB〔，12,000rpm離心30se掉廢液。500μl漂洗液WB，12,000rpm30sec，棄掉廢液。將吸附柱EC放回空收集管中，12,000rpm2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反響。取出吸附柱EC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μl洗脫緩沖液E〔洗脫緩沖液事先在65-7℃水浴中加熱效果更好，室溫放置2mi12,000rpm離1min。假設(shè)需要較多量DNA，可將得到的溶液重參與吸附柱中，離心1min。〔PCR〕:100μlPCR擴(kuò)增后體系或者酶切后體系參與500μl溶膠/結(jié)合液DB〔假設(shè)初始體系小于100μ，請(qǐng)事先用雙蒸水調(diào)整至100μ。將上一步所得溶液參與吸附柱EC〔吸附柱放入收集管中1mi12,000rpm離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液。從今步驟參見瓊脂糖凝膠DNA6-9。DNA線，并且盡可能的縮短紫外線下處理的時(shí)間。全部的溶液應(yīng)當(dāng)是澄清的，假設(shè)環(huán)境溫度低時(shí)溶液可能形成沉淀，此時(shí)不應(yīng)當(dāng)直接使37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。使用前應(yīng)當(dāng)恢復(fù)到室溫。第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中參與指定量無水乙醇，參與后請(qǐng)準(zhǔn)時(shí)打鉤標(biāo)記已參與乙醇，以免屢次參與!溶膠液/結(jié)合液中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避開沾染皮膚，眼睛和衣服。假設(shè)沾染皮膚、眼睛時(shí)，要馬上用大量清水或者生理鹽水沖洗。pH值≤7.5DNA的效率最高。假設(shè)切下來的凝膠中含有電泳緩沖液太多，造成溶膠后溶膠液pH偏高，會(huì)導(dǎo)致回收率降低。溶膠后，假設(shè)溶膠液照舊保持黃色，說明pH正常；假設(shè)變成橘紅色或者淡紫色，說明pH偏高，可在膠充分溶解后加5-10μl3M醋酸鈉〔pH5.2〕pH5-7〔黃色。洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反響。也可以使用水洗脫，但應(yīng)當(dāng)確保pH7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫，DNA片段應(yīng)當(dāng)保存在－20℃。DNATE緩沖液洗脫〔10mMTris-HCl，1mMEDT，pH8.，但是EDTA可能影響下游酶切反響，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。14PCRT載體和感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化〔參照TaKaRapMD18-T載體試劑盒和博邁德感受態(tài)試劑盒〕一、試驗(yàn)?zāi)康模篜CR產(chǎn)物的連接和克隆。二、試驗(yàn)原理：T3’端添加了“T”DNA聚合酶進(jìn)展PCRPCR3’末端添加一個(gè)“A”T載體可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。TLacZβ-半乳糖苷酶，在含有IPTG，X-gal的平板培育基上，可進(jìn)展藍(lán)白斑篩選，選擇陽性克隆。大多數(shù)T載體供給氨芐青霉素兩種篩選標(biāo)記，有的T載體供給氨芐青霉素和卡那霉素兩種篩選標(biāo)記。三、試驗(yàn)試劑：T載體試劑盒PCR回收產(chǎn)物ddH2O感受態(tài)細(xì)胞LB培育基固體培育基：10g/LNaCl,10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,15g/L瓊脂粉液體培育基：10g/LNaCl,10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物氨芐青霉素〔Ampicillin,Amp〕儲(chǔ)存液：100mg/ml工作液：100μg/ml異丙基硫代半乳糖苷〔Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG〕儲(chǔ)存液：100mM工作液：0.5mM5-溴-4-5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷〔5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosideX-Gal〕儲(chǔ)存液：20mg/ml工作液：200μl/100mlLB50μl/9cm平板四、試驗(yàn)步驟：試劑使用量〔試劑使用量〔μl〕T載體0.5PCR回收產(chǎn)物適量SolutionⅠ510一般狀況下，連接時(shí)載體DNA1:2~10。1μlT載體〔50μg〕0.03pmol。PCR產(chǎn)物的使用量〔ng〕=nmolx660xbp數(shù)在PCR1630min。室溫〔25℃〕>2Kb的PCR產(chǎn)物連1h。中〔一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50100μ，置于冰浴中。向感受態(tài)細(xì)胞懸液中參與連接產(chǎn)物〔DNA體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的格外之一；為防止轉(zhuǎn)化試驗(yàn)不成功，可以保存局部連接反響液，以重轉(zhuǎn)化，將損失降到最低，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰中放置30mi。將離心管置于42℃水浴中放置90sec，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2min，該過程不要搖動(dòng)離心管。向每個(gè)離心管中參與500μl不含抗生素LB培育基，混勻后37℃振蕩培育〔150rp，搖床振蕩培育45-60mi取適量菌液〔連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化菌液建議離心重懸于200μlLB液體培育基，取100μl用于涂布；保存剩余的菌液于4℃冰箱中，視平板上菌落生長狀況打算去留〕加到含有X-Gal、IPTG、AmpLB固體培育基平板上，用細(xì)菌涂布器或玻璃珠將細(xì)胞均勻涂開。平板中的液體完全吸取后，倒置平板，37℃培育12-16h。選擇白色菌落進(jìn)展鑒定。五、留意事項(xiàng)PCR產(chǎn)物最好切膠回收，以免雜質(zhì)影響克隆效率。SolutionⅠ需要在冰中溶解，并避開反復(fù)凍融。感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70的轉(zhuǎn)化效率。最好使用穎配置的培育基。菌落〔液〕PCR一、試驗(yàn)?zāi)康模簷z測(cè)重組質(zhì)粒是否成功，外源片段是否正確插入到質(zhì)粒載體中。二、試驗(yàn)原理：直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)展PCR擴(kuò)增外源插入片段。三、試驗(yàn)試劑：ddH2OPCRMix〔TaKaRaPremixTaq〕引物L(fēng)B培育基TAE電泳緩沖液瓊脂糖四、試驗(yàn)步驟〔PCR：3l無菌水。為平板上將要挑取的菌落標(biāo)上號(hào)碼，用無菌牙簽選擇單菌落，將菌落轉(zhuǎn)至PCR管中〔牙簽在無菌水中洗一下，然后將牙簽點(diǎn)在LB平板上，記錄號(hào)碼。試劑使用量〔μl〕PCR試劑使用量〔μl〕PCRMix5I0.5II0.5ddH2O3目的基因PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。五、試驗(yàn)步驟〔PCR：挑起白色單菌落，于含有相應(yīng)抗生素的1mlLB3-4h。1μl菌液作為PCR反響模板，其余菌液連續(xù)培育用于保存。試劑使用量試劑使用量〕菌液1PCRMix5I0.5II0.52目的基因PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。DNA的提取〔參照博邁德質(zhì)粒小量快速提取試劑盒〕一、試驗(yàn)?zāi)康模喝コ蚪MDNADNA，可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR等試驗(yàn)。二、試驗(yàn)原理：承受改進(jìn)SDS-pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最終低鹽、pH值的洗脫緩沖液將純潔質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。三、試劑盒組成：RNaseA溶液溶液P1、P2和P3漂洗液洗脫液吸附柱收集管四、試驗(yàn)步驟：挑起白色單菌落，于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培育基中培育8-12h。1ml菌液保存，其余菌液用于提取質(zhì)粒DNA。1.5-4.5ml過夜培育菌液，9,000rpm30sec，盡可能的倒干上清，收集菌體。250μl溶液P1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。250μl的溶液P24-7次使菌體充分裂解。350μl溶液P34-7次，充分混勻時(shí)會(huì)消滅白色絮狀沉淀，13,000rpm5min，留神取上清。將上一步所得上清參與吸附柱AC〔吸附柱放入收集管中，13,000rpm離心sec，倒掉收集管中的廢液。參與500μl漂洗液W〔12,000rpm離心棄掉廢液。500μl漂洗液WB，12,000rpm30sec，棄掉廢液。將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm2min液中殘留乙醇抑制下游反響。取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μl洗脫緩沖液E〔洗脫緩沖液事先在65-7℃水浴中加熱效果更好，室溫放置rpm離心1min。假設(shè)需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重參與離心吸附柱中，1min。洗脫體積越大，洗脫效率越高。假設(shè)需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)削減洗脫體積，30μl，體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率，削減質(zhì)粒產(chǎn)量。電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA提取結(jié)果。五、留意事項(xiàng)：第一次使用時(shí)，將試劑盒所帶的全部RNaseA參與溶液P1后〔100μg/ml〕2-8℃保存。環(huán)境溫度低時(shí)溶液P2中SDS可能會(huì)析出渾濁或者沉淀37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要猛烈搖擺，以免形成過量的泡沫。溶液P3中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避開沾染皮膚、眼睛和衣服。假設(shè)沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。將溶液P3放在冰上預(yù)冷，可以提高產(chǎn)量。第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB在方框打鉤標(biāo)記已參與乙醇，以免屢次參與!洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反響。也可以使用水洗脫，但應(yīng)當(dāng)確保pH7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫，DNA片段應(yīng)當(dāng)20℃。DNA片段假設(shè)需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫〔10mMTris-HC1mME