心肌缺血再灌注時Gsα和Giα蛋白含量mRNA水平變化及意義【摘要】目的：研究新生豚鼠心肌缺血再灌注時Gsα和Giα蛋白含量及其mRNA水平的變化以及與心功能變化的關系.方法：30只新生豚鼠隨機分為3組，建立離體心臟左心做功模型.組Ⅰ：離體心臟缺血90min；組Ⅱ：缺血時予ThomasⅡ號液；組Ⅲ：缺血時予冷血心停搏液.各組均再灌注60min.檢測心功能指標，Gsα和Giα蛋白含量及其mRNA水平的變化.結果：組Ⅰ和組Ⅱ在再灌注時的心功能明顯受損，組Ⅲ在再灌注結束時無明顯變化.組Ⅰ和組Ⅱ在缺血后和再灌注后Gsα蛋白含量分別為缺血前的%,%,%和%，GsαmRNA水平分別為缺血前的%,%,%和%，明顯降低()；Giα蛋白含量分別為缺血前的%,%,%,%，Gi2αmRNA水平分別為缺血前的%,%,%和%，顯著升高().組Ⅲ在再灌注后Gsα和Giα蛋白含量及其mRNA恢復至缺血前的水平.結論：Gsα和Giα蛋白的平衡遭受破壞可能是未成熟心肌缺血再灌注損傷發(fā)生的機制之一.

【關鍵詞】心肌缺血；心肌再灌注損傷；GTP結合蛋白質類；心麻痹液；豚鼠

0引言

鳥嘌呤核苷酸偶聯蛋白(G蛋白)在細胞信號轉導過程中起著“電話交換機(switchboard)樣”作用［1］，與心臟病理生理過程密切相關［2］.對心肌缺血再灌注過程中G蛋白變化的研究有益于增強對心肌缺血再灌注損傷的認識，是一值得探討的課題.有關未成熟心肌缺血再灌注時興奮性鳥核苷藕聯蛋白α亞基(Gsα)和抑制性蛋白α亞基(Giα)蛋白含量的變化及其mRNA水平的變化鮮見研究報道［3］，我們擬以新生豚鼠為研究對象，利用離體工作心臟模型，運用Western印跡分析和Northern印跡分析等方法對此進行研究.

1材料和方法

材料

①實驗分組和模型：0~2d齡新生豚鼠，雌雄不拘，體質量50~80g.實驗隨機分為3組.建立離體心臟順灌左心做功模型［4］：取豚鼠心臟,將主動脈斷端套于主動脈插管上，行Langendorff逆灌，灌注液為KH液，心臟復跳.行左房插管,停止逆灌，經左房順行灌注.停止順灌，Ⅰ組于20℃全心缺血90min，Ⅱ組(Thomas組)和Ⅲ組在缺血開始、第30min和第60min時經主動脈分別逆灌10℃ThomasⅡ號液和冷血心停搏液.之后，三組均給予37℃氧合KH液逆灌，使心臟復跳，爾后再灌60min.②抗體和cDNA探針RM/1Gs蛋白多克隆抗體和AS/7Gi蛋白多克隆抗體；大鼠Gsα和Gi2αcDNA探針，長度分別為1737bp和1748bp.

方法

心功能指標測定在缺血前和再灌注15，30，45和60min時，將左心室測壓管連接于MPAIV型多導生物信號分析系統(tǒng)，測定各組左室收縮峰壓、左室舒張末壓、左室內壓正負相最大變化速率、心輸出量.

印跡分析將冷凍心肌組織置于4℃預冷的含1mol/LMgCl2，25mol/L三氨甲烷/鹽酸，mol/L甲苯磺酰氟和1mol/L二硫蘇糖醇的心肌勻漿液中，勻漿制備膜蛋白，-70℃貯存?zhèn)溆?120g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，每一樣品上樣75μg，以電轉移的方式轉移至硝酸纖維素膜上.將膜封閉后，與抗Gs和抗Gi反應1h，洗去抗體后將膜置于1∶500的堿性磷酸酶標記的IgG中反應1h，Tris緩沖鹽溶液充分洗滌，以NBT+BCIP顯色，最后攝片記錄.

印跡分析以Trizol液提取心肌總RNA，用紫外分光光度法測定并計算其濃度和純度，將RNA樣品上樣至10g/L變性瓊脂糖膠上電泳，毛吸法轉移至硝酸纖維素膜上，80℃真空烘干.硝酸纖維素膜50℃雜交過夜后，在預雜交液中加入50mg/L鮭魚精DNA和32P標記的cDNA探針，50℃雜交過夜.-70℃放射自顯影，最后對X膠片進行掃描分析.βactincDNA作為內參照.

和蛋白質含量的確定Western印跡分析的結果用測得的目標帶的吸光度×面積表示，爾后按占缺血前的百分比進行統(tǒng)計.Northern印跡分析則將所測值用內參照βactin校正后再按占缺血前的百分比進行統(tǒng)計分析.

統(tǒng)計學處理：各組以缺血前值為100%，并計算缺血后和再灌注后實測值分別與缺血前值的百分率.數值以x±s表示，用重復測量方差分析進行統(tǒng)計處理，為有統(tǒng)計學意義.

2結果

心臟功能的變化再灌注時，Ⅰ組和Ⅱ組的LVPSP,+dp/dtmax,-dp/dtmax和CO在各時相點均顯著降低，而LVEDP顯著升高；Ⅲ組在再灌注60min時各心功能指標均恢復至與缺血前相當的水平；Ⅰ組和Ⅱ組的LVPSP,+dp/dtmax,-dp/dtmax和CO在各時相點均顯著低于，而LVEDP顯著高于Ⅲ組

心肌Gsα蛋白和Giα蛋白含量的變化三組缺血前的Gsα和Giα蛋白水平無明顯差異.缺血后，Ⅰ組和Ⅱ組Gsα蛋白水平顯著低于缺血前()，Giα蛋白水平顯著高于缺血前和Ⅲ組，兩組之間尚無明顯差異；再灌注后，Ⅲ組的Gsα和Giα蛋白水平與缺血前無明顯差異，且分別明顯高于和低于Ⅰ組和Ⅱ組.Gsα蛋白呈現出Mr45×103和52×103兩條蛋白帶，Giα蛋白呈現出一Mr41×103蛋白帶(Fig1).表2新生豚鼠心肌Gsα蛋白和Giα蛋白的變化

心肌GsαmRNA和Gi2αmRNA水平的變化三組缺血前的GsαmRNA和Gi2αmRNA水平無明顯差異().缺血后，Ⅰ組和Ⅱ組的GsαmRNA和Gi2αmRNA水平明顯低于和高于缺血前和Ⅲ組.再灌注后，Ⅲ組GsαmRNA和Gi2αmRNA水平與缺血前無明顯差異()，且分別明顯高于和低于Ⅰ組和Ⅱ組

3討論

心肌缺血再灌注損傷及其保護一直受到重視［5，6］.G蛋白作為細胞信號轉導過程中的“電話交換機”［4］，在許多心肌病理過程中發(fā)揮作用［5］.未成熟心肌缺血再灌注時G蛋白的變化鮮見研究報道［6］.本組研究結果顯示，Ⅰ組心肌缺血后的Gsα蛋白水平明顯降低，再灌注后Gsα蛋白量雖有所恢復，仍明顯低于缺血前.GsαmRNA的表達與Gsα蛋白含量的變化平行.缺血后Gi2αmRNA水平升高，再灌注后雖有所下降，仍明顯高于缺血前，并由此引起Giα蛋白量在缺血后和再灌注后的升高.由此推測，Gs和Gi的平衡遭受破壞是未成熟心肌缺血再灌注損傷發(fā)生的機制之一.

ThomasⅡ號液對未成熟心肌缺血再灌注損傷的作用尚有爭議［7］，冷血心停搏液對成熟和未成熟心肌均具良好保護作用［8］.本結果提示，Ⅱ組缺血再灌注后的GsαmRNA水平和Gsα蛋白含量明顯降低，而Gi2αmRNA水平和Giα蛋白含量顯著增加.Ⅲ組缺血后GsαmRNA和Gsα以及Gi2αmRNA和Giα蛋白水平雖有變化，但在再灌注后恢復至與缺血前相當的水平.可見，ThomasⅡ液對未成熟心肌缺血再灌注無有效保護可能是由于該液失于對未成熟豚鼠心肌細胞G蛋白的保護，冷血心停搏液對未成熟豚鼠心肌的保護作用與其對G蛋白的保護有著密切的關系.這從另一個角度說明了ThomasⅡ液和冷血心停搏液的不同心肌保護作用的可能機制.

【參考文獻】

［1］NeerEJ.HeterotrimericGprotein:Organizersoftransmembranesignals［J］.Cell,1995；80(2):249-257.

［2］BoozGW,DayJN,BakerKM.InterplaybetweenthecardiacreninangiotensinsystemandJAKSTATsignaling:Roleincardiachypertrophy,ischemia/reperfusiondysfunction,andheartfailure［J］.JMolCellCardiol,2002；34(11):1443-1453.

［3］BorasoA,CeconiC,CargnoniA,etal.Betaadrenergicreceptorsandintracellularsignallingpathwayinstunnedandnonischemicregionsofpigmyocardium［J］.BasicResCadiol,2001(4)；96:388-394.

［4］鐘前進,劉欲團,曹新來,等.新生豚鼠離體心臟順灌左心做功模型的建立［J］.中國病理生理雜志,1999；15(2):191-192.

ZhongQJ,LiuYT,CaoXL,etal.Establishmentofmodelofisolatedperfusedleftsideworkingheartfromnewbornguineapig［J］.ChinJPathophysiol,1999；15(2):191-192.

［5］馬蘭香,賈國良,張清,等.高、低劑量極化液對缺血/再灌注心肌保護作用的對比研究［J］.第四軍醫(yī)大學學報,2003;24(22):2087-2090.

MaLX,JiaGL,ZhangQ,etal.ComparativestudyonmyocardialprotectionbyhighdoseGIKandlowdoseGIKduringmyocardialischemiaandreperfusion［J］.JFourthMilMedUniv,2003;24(22):2087-2090.

［6］趙建洪,程彥斌,張正義,等.嗎啡對大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及其對心肌細胞凋亡的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報,2004;25(16):1460-1463.

ZhaoJH,ChenYB,ZhangZY,etal.Protectiveeffectsofmorphineonacutemyocardialischemiareperfusioninjuryinratanditsinfluenceonapoptosisofcardiomyocytes［J］.JFourthMilMedUniv,2004;25(16):1460-1463.

［7］WangJ,ZhouX,ZhaoY,etal.Myocardialprotectionofimmaturerabbits:polarizingvers