響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助固定化酶-化學(xué)法提取并分析常見主食膳食纖維含量及合理化飲食建議摘要隨著人們生活水平的提高，大家對高熱量、高蛋白、高脂肪食品和精細食品攝入量大大增加，膳食纖維（Dietaryfiber）的攝入量相對減少，忽略了膳食營養(yǎng)的平衡性。而膳食纖維作為“第七大營養(yǎng)素”具有降低血液中的膽固醇含量，促進腸道蠕動，清除體內(nèi)毒素，進而有效防止結(jié)腸癌等病癥發(fā)生的作用。雖然膳食纖維有很多的好處，但不宜過量。過量食用膳食纖維會影響其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，且容易引發(fā)腸阻塞甚至胃穿孔，特別是患有胃炎的人群更應(yīng)當(dāng)減少粗膳食纖維的攝入，防止對胃黏膜的進一步破壞，預(yù)防急性胃穿孔。我們組為優(yōu)化不同人群的飲食結(jié)構(gòu)，擬定以山東人日常生活中常見的幾種主食為原料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，采用微波輔助固定化酶-化學(xué)結(jié)合的方法，將粉碎后的樣品經(jīng)微波預(yù)處理后，用酶解法水解樣品中的淀粉，濾去包埋了酶的凝膠珠防止酶的浪費，用化學(xué)法除去樣品中的蛋白質(zhì)和脂肪，進一步提取原料中的膳食纖維，運用origin軟件，對不同煎餅中膳食纖維含量進行分析，并繪制膳食纖維含量差異回歸分析圖等圖表。本實驗通過微量物重分析法表征不同煎餅中膳食纖維含量差異，從而為山東人合理搭配飲食提供可靠的數(shù)據(jù)支持。關(guān)鍵詞:膳食纖維主食響應(yīng)面固定化酶酶-化學(xué)法1前言1.1本研究的背景與意義1.1.1研究背景隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們的生活水平穩(wěn)步提高。但由于飲食不當(dāng)而引起的相關(guān)疾病，也不斷出現(xiàn)。2013年1月22日，美國癌癥協(xié)會（AmericanCancerSociety，簡稱ACS）最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)（《2013年癌癥事實與數(shù)字》）指出：發(fā)病率最高的三大癌癥是肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌。尤其是結(jié)腸癌的發(fā)病率，正逐年上升。近年來，相關(guān)研究表明，食物中的膳食纖維可以有效預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生。而由于地區(qū)飲食習(xí)慣的不同也導(dǎo)致人們對膳食纖維的攝入量不同，進而各地的發(fā)病率也有很大的差異。另外，膳食纖維還具有降低血脂，預(yù)防冠心病，改善糖尿病狀況等作用。我國營養(yǎng)學(xué)會頒布《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》規(guī)定，成人膳食纖維日攝入量為30g左右，而我國居民膳食纖維實際攝入量僅為14g左右。然而，特殊的人群有對膳食纖維特殊的要求，例如兒童和老人應(yīng)當(dāng)適量減少，每日食用量最好不要超過18g。患有腸胃病的人群應(yīng)當(dāng)減少膳食纖維的攝入，特別是粗膳食纖維，防止造成胃粘膜進一步破損，甚至急性胃穿孔。而當(dāng)今快節(jié)奏的社會生活，上班族，學(xué)生族不規(guī)律飲食，導(dǎo)致腸胃病高發(fā)，而關(guān)注腸胃病人群合理飲食顯得刻不容緩。1.1.2研究的意義近年來，盡管相關(guān)人士對膳食纖維的研究比較深入，但對飲食中的膳食纖維研究以及給消費者提供合理的膳食建議等方面還很不完善。為此，本研究通過對不同煎餅中膳食纖維的提取及含量的測定，以期為大家提供合理的飲食方案，達到對膳食纖維攝取的最適量，增強身體素質(zhì)，減少過量食用造成的危害。1.2膳食纖維簡介膳食纖維作為目前國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)研究的重點之一，被譽為人類的第7大營養(yǎng)素。膳食纖維雖然不可被人體消化吸收，但它可以促進腸道的蠕動，預(yù)防便秘。另外，提高膳食纖維的攝入量，可以減少熱量的攝取，有利于減肥。而膳食纖維最主要的功效是能夠有效預(yù)防結(jié)腸癌和直腸癌。除此之外，膳食纖維還具有降低血脂，預(yù)防冠心病，改善糖尿病癥狀，改善消化系統(tǒng)等作用。但是，過量食用也可能造成不必要的危害。如果每天都能夠攝取適量的膳食纖維以及其他人體所必需的物質(zhì)，加上適當(dāng)?shù)捏w育鍛煉，長此以往，國民身體素質(zhì)會有質(zhì)的提升。1.3固定化酶-化學(xué)法目前國內(nèi)外提取膳食纖維的方法主要有AOAC法、膜分離法、熱水提取取法、發(fā)酵法、化學(xué)法和酶法等方法。相對于前幾種方法而言，化學(xué)法和酶法具有一定的優(yōu)勢，而單一的化學(xué)法和酶法都有其難以克服的弊端。本研究就是在此基礎(chǔ)上，把酶法和化學(xué)法結(jié)合，集中兩種方法的優(yōu)點，更有效的提取膳食纖維。固定化酶-化學(xué)法就是將酶通過化學(xué)鍵連接到天然的或合成的高分子載體上，使用偶聯(lián)劑通過酶表面的基因?qū)⒚附宦?lián)起來，而形成相對分子質(zhì)量更大、不溶性的固定化酶。而酶的活性不受影響，并且可以增加對酸、堿和溫度等的穩(wěn)定性，具有一定的機械強度。此外，還具有易于從反應(yīng)體系中分離，而且易于控制，能夠反復(fù)多次使用，降低酶的成本的優(yōu)點。1.4響應(yīng)面優(yōu)化法本研究通過響應(yīng)面分析法來優(yōu)化提取的工藝，相對于傳統(tǒng)的正交法，響應(yīng)面法是利用合理的試驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。它具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究集中因素交互作用等優(yōu)點。在本研究中，使用此方法能過明顯提高膳食纖維的提取率，是研究結(jié)果更具有說服力、更接近實際。2實驗?zāi)康耐ㄟ^響應(yīng)面法優(yōu)化膳食纖維的提取工藝。通過固定化酶技術(shù)實現(xiàn)酶的回收再利用。采用酶-化學(xué)法提取不同煎餅中的膳食纖維。對比分析不同主食的膳食纖維含量,給泰安市喜好煎餅的市民一個合理化的飲食建議。3實驗原理膳食纖維（Dietaryfiber，DF）主要由可食性植物細胞壁殘余物（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等）及與之締合相關(guān)物質(zhì)組成化合物，一般不能被人體消化酶消化。根據(jù)水溶性不同，膳食纖維可被分為水溶性膳食纖維（SDF）和水不溶性膳食纖維（IDF）。SDF包括β–葡聚糖和阿拉伯木聚糖，IDF包括木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。不溶性膳食纖維的分子結(jié)構(gòu)如下：（主要為纖維素）可溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)如下：（主要為β-葡聚糖）微波預(yù)處理是利用頻率為300-300000MHz的電磁波輻射提取物，再交頻磁場、電場作用下，提取物內(nèi)的極性分子取向隨電場方向改變而變化，從而導(dǎo)致分子旋轉(zhuǎn)、振動或擺動，加劇反應(yīng)物分子運動及相線間的碰撞頻繁率，使分子在極短時間內(nèi)達到活化狀態(tài)，比傳統(tǒng)加熱式均勻、高效。微波提取過程的原理主要有二個方面：一是強化了傳遞過程，熱量通過微波轉(zhuǎn)換得到而不存在傳遞的問題，從而實現(xiàn)高強度的均勻加熱。二是植物內(nèi)介電系數(shù)較大的極性分子吸收微波產(chǎn)生熱量，發(fā)生汽化或膨脹，內(nèi)滲透壓增加而破壞植物的細胞結(jié)構(gòu),使擴散孔道變大，提取速度發(fā)生根本性變化。植物結(jié)構(gòu)被破壞是提高提取效率的主要方法。固定化酶技術(shù)是為了提高酶的利用率，將酶通過一定的的理化作用，將其固定在聚合物或者載體上并保持其活性。固定化酶技術(shù)在在該實驗中的應(yīng)用提高了產(chǎn)物的純度，具有充分利用資源，節(jié)省能源等優(yōu)點。通過固定化的酶使淀粉分解為葡萄糖、糖醛酸等單糖后溶解除去，得到濾液，用乙醇沉淀即得SDF；去除淀粉后運用化學(xué)堿法即采用氫氧化鈉浸泡可使其中的蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生水解或增溶（前者在堿的作用下降解為可溶性的小分子肽和游離氨基酸，脂肪在堿性條件通過皂化反應(yīng)，水解為甘油和脂肪酸的鹽類，從而更容易漂洗除去），以提高膳食纖維的純度，漂洗過濾干燥即得IDF。分別分析IDF和SDF分量，作為依據(jù)，為大家提供合理化的飲食建議。4實驗設(shè)備序號設(shè)備及用品名稱規(guī)格數(shù)量1高速中藥粉碎機(打粉機)單次粉碎量10-800克，細度20-200目12移液器量程：0.05mL-5mL3量筒4電子分析天平精確度：0.0001g5玻璃棒56燒杯7電恒溫水浴鍋0-100℃18真空抽濾機泵或高速離心機19容量瓶量程：200ml510注射器（帶針頭）自備11溫度計量程：0-100℃12鐵架臺5實驗材料及試劑5.1試劑的配制序號試劑及藥品配制用量1鹽酸（1mol/L）2氫氧化鈉（1%-2%）3無水乙醇4過氧化鈉5蒸餾水6海藻酸鈉5.2酶制劑列表序號名稱最適溫度/℃最適pH用量1α-耐熱淀粉酶906-85.3材料的處理將選取的饅頭、米飯、玉米煎餅、小米煎餅干燥粉碎干燥過篩。6實驗操作步驟6.1前期準備中心組合設(shè)計（CCD）實驗單因素實驗中心組合設(shè)計（CCD）實驗單因素實驗PB實驗最陡爬坡實驗通過上述實驗設(shè)計，得到最終最優(yōu)提取條件，在最優(yōu)條件下進行實驗。加ccd組合實驗表：空著數(shù)據(jù)不填，加說明結(jié)果怎么分析，用何軟件6.2工藝流程過濾除酶堿液除去蛋白質(zhì)及脂肪固定化淀粉酶水解粉碎，微波預(yù)處理過濾除酶堿液除去蛋白質(zhì)及脂肪固定化淀粉酶水解粉碎，微波預(yù)處理乙醇沉淀上清液(SDF)乙醇沉淀上清液(SDF)干燥，稱量DF抽濾法過濾（或離心）分離干燥，稱量DF抽濾法過濾（或離心）分離脫色洗滌沉淀物（IDF）脫色洗滌沉淀物（IDF）6.3實驗材料的準備與預(yù)處理6.3分別稱量各樣品適量（約50g）粉碎全部過40目篩，放入密閉容器中，防止試樣成分變化，標號1-A、1-B、2-A、2-B、3-A、3-B、4-A、4-B（即每個樣品設(shè)置2個平行樣）待用。6.3將上述樣品放入微波爐內(nèi)用微波進行預(yù)處理5min。6.4樣品的測定6.4取樣品1-A、1-B、2-A、2-B、3-A、3-B、4-A、4-B各10g粉末經(jīng)固定化的a-耐熱淀粉酶設(shè)定水浴溫度65℃,酶解1h，均勻攪拌。水解除去淀粉后，紗布過濾出去凝膠珠。6.4取100ml氫氧化鈉溶液于樣液中，在75℃電熱恒溫水浴鍋水浴30min。30min后取鹽酸溶液調(diào)節(jié)樣液pH值至中性pH=7浸泡片刻。然后進行高速離心（或三次抽濾）。沉淀物：加入50ml過氧化鈉混合液，混合均勻，浸泡30min脫色，隨后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，過濾烘干并稱重。即得樣品中不溶性膳食纖維質(zhì)量。上清液：加入4倍于濾液的無水乙醇沉淀10min，用濾紙過濾，烘干沉淀物，稱重。即得樣品中水溶性膳食纖維質(zhì)量。7結(jié)果及計算樣品測量值1-A1-B2-A2-B3-A3-B4-A4-BSDF重量均量IDF重量均量DF總量公式：DF=SDF+IDF膳食纖維含量：DF%=(a+b)/10*100%8注意事項固定化酶水解一般需要的時間稍微長一些。回收的凝膠珠應(yīng)當(dāng)妥善低溫保存。水解操作中控制好溫度、PH等條件。高速中藥打碎機的使用過程中應(yīng)當(dāng)注意安全。9費用預(yù)算(單位：人民幣)物品名稱規(guī)格用量（g）費用預(yù)算（元）原料100g/種40015酶試劑4000u/g20200（已自備）其它12費用合計227參考文獻JohnSeffrin.2013年癌癥事實與數(shù)字AmericanCancerSociety2013AnneS.Meyer,BirgitteP.Dam,HelleN.Larke.Enzymaticsolubilizationofapectinaceousdietaryfiberfractionfrompotatopulp:Optimizationofthefiberextractionprocess[J]BiochemicalEngineeringJournal2009,4.3汪志慧等響應(yīng)曲面法優(yōu)化雙酶法提取蓮房原花青素食品安全2011王秀奇等基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗高等教育出版社1999年版JoanneL.Slavin.Dietaryfiberan