動物生物技術轉化子的篩選概念

克隆子：將攝取外源DNA分子并能使該分子在其中穩定維持的受體細胞統稱為克隆子。轉化子：把采用各種轉化方法或轉導方法獲得的克隆子叫做轉化子（導入外源DNA分子后能穩定存在的受體細胞稱為轉化子），現在這兩者有通用的趨向。重組子：含有重組DNA分子的克隆子被稱為重組子，如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或期望重組子。克隆子的篩選轉化子重組子目的重組子三者的關系轉化子的篩選與重組子的鑒定轉化子重組子期望重組子克隆子的篩選

為什么要進行克隆子的篩選？在重組DNA分子的轉化、轉染或轉導過程中，一般僅有少數受體細胞成為克隆子。必須采用合適的方法從大量的細胞背景中篩選出期待的克隆子。克隆子的篩選：經過各種方法將外源DNA分子導入受體細胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選。1、在連接產物中既有載體和一個或數個串聯目的基因的連接2、也有載體自連3、還有目的DNA分子自連4、更多的是違法生連接反應的載體和目的DNA片段

重組可能出現四種情況轉化子的篩選與重組子的鑒定

轉化子的篩選與重組子的鑒定方法基于載體選擇標記基因篩選轉化子

利用載體DNA分子上所攜帶的選擇性遺傳標記基因篩選轉化子

基于報告基因篩選轉化子

報告基因多少是酶基因，或組裝在載體中，或作為外源DNA的一部分。由于受體細胞內報告基因的表達，出現新的遺傳性狀，以此識別被轉化的細胞或未必轉化的細胞。

基于形成噬菌斑篩選轉化子

對于λDNA載體系統而言，可以采用是否能夠形成噬菌斑來進行篩選。轉化子的篩選

基于載體選擇標記基因篩選抗藥性篩選法（插入失活、插入表達）營養缺陷性篩選法顯色模板篩選法除草劑抗性篩選法@1234轉化子的篩選

基于載體遺傳標記的篩選與鑒定

在構建基因工程載體系統時，通常在載體DNA分子中組裝了一種或兩種選擇標記基因，在受體細胞內進行表達，呈現出特殊的表型或遺傳學特性，作為篩選轉化子的依據。轉化子的篩選

1、抗藥性篩選篩選大腸桿菌轉化子的部分抗生素抗性基因和相應的選擇藥物轉化子的篩選

1、抗藥性篩選抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本原理：抗藥性篩選法可區分轉化子與非轉化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRⅠ位點：

非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHⅠ位點：

非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs轉化子的篩選

1、抗藥性篩選抗藥性篩選法的基本操作：先將轉化液涂布含有Ap的平板，再將Ap平板上的轉化子影印到含有Ap和Tc的平板上在Ap平板生長、但在

Ap和Tc平板上不長的轉化子即為重組子。轉化子的篩選

插入失活篩選法

如pBR322質粒載體，有Tcr和Apr兩個抗藥性篩選基因，當外源DNA片段插入BamHⅠ酶切位點上時，使Tcr基因表現插入失活，破壞了Tcr基因表達，故陽性重組子表現Tcs表型，而質粒本身表現Tcr表型。所以當轉化細菌液涂布在Ap固體培養基上，轉化子及非轉化子都能長成菌落，當轉化細菌液涂布在Tc平板上時，含有外源DNA插入片段的陽性重組子的轉化菌不能長而成菌落。

利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標記基因的表達，由此進行轉化子的篩選。有些載體在設計時，在篩選標記基因前面連接上一段負調控序列，當插入失活該負調控序列時，其下游的篩選標記基因才能表達。例如pTR262質粒載體，它由pBR322衍生而來，其Tcr基因的上游含有一段λ噬菌體DNA的CI阻遏蛋白編碼基因及其調控序列，CI基因表達的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表達。當外源DNA片段插入CI基因的HindⅢ或BglⅠ位點上時，CI基因失活，Tcr基因因阻礙解除而得以表達，故陽性重組子為Tcr表型，而質粒本身為Tcs表型，當轉化細菌涂布在Tc平板上時，只有含有外源DNA插入片段的陽性重組子的轉化菌才能生長成菌落。轉化子的篩選插入表達篩選法

常見的營養缺陷型篩選標記：用于大腸桿菌的營養標記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳動物細胞的營養標記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應的受體細胞則選擇tk--缺陷型。轉化子的篩選營養缺陷型篩選DNA合成途徑有兩種

常用于高等哺乳動物典型的篩選方式：HAT選擇法HAT選擇法：由于選擇培養基中含有次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），這是一種選擇性培養基，主要針對含有選擇標記的目的基因轉化子的篩選。基本原理：利用培養基中的葉酸類似物氨基蝶呤(APT)阻斷細胞核苷酸的正常合成途徑，啟動以次黃嘌呤為底物的補救合成途徑（不受氨基蝶呤的抑制，能繼續合成出所需核苷酸）。HAT培養基中有外源的胸苷，通過胸苷激酶的作用，tk+能以其為底物合成出TTP，則tk+細胞可繼續存活；而tk-細胞無這種合成作用，則死亡。轉化子的篩選篩選方式

顯色篩選法的基本原理：轉化子的篩選顯色互補篩選法

顯色篩選法可以區分轉化子與非轉化子，也可區分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產物能使細胞產生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應）等。轉化子的篩選

顯色篩選法顯色篩選法的基本操作：

將外源基因克隆pUC18的lacZ’標記基因內部，使之失活，此時重組子呈Apr、lacZ—，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落。

轉化子的篩選α互補的檢測

α互補的檢測

轉化子的篩選轉化子的篩選除草劑抗性篩選法由于植物細胞對多數抗生素不敏感，所以常用抗除草劑基因作為選擇標記基因。pat基因編碼磷化乙酰轉移酶（PAT），使轉化子對含有磷化麥黃酮（PPT）成分的除草劑具有抗性。sul基因來源于抗藥性質粒R46，編碼二氫喋呤合成酶，使轉化子對磺胺類除草劑有抗性。csV1-1基因編碼乙酰乳酸合成酶，使轉化子對磺酰脲類除草劑有抗性。epsps基因表達產物是5-烯酮丙酮酸莽草酸-3磷酸合成酶EPSP突變體，使轉化子能抗甘草磷。轉化子的篩選基于報告基因篩選

報告基因：是指其編碼產物能夠被快速地測定，常用來判斷外源基因是否已經成功地導入宿主細胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因。常用的報告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類或其他特殊產物的基因等。轉化子的篩選基于報告基因篩選克隆子抗生素抗性基因作為報告基因①新霉素磷酸轉移酶基因（nptⅡ）：抗新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418（氨基糖苷類抗生素）等抗生素，成為篩選動植物轉化子的選擇標記基因。②潮霉素磷酸轉移酶基因（hpt）：賦予轉化子能抗潮霉素，作為選擇標記基因主要用于篩選動植物轉化子。潮霉素是致癌物質，操作時應慎重。③氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）：也被用于篩選動植物轉化子的標記基因。轉化子的篩選基于報告基因篩選克隆子β-葡萄糖酸酶基因（gus）作為報告基因gus的基因產物β-葡萄糖酸酶（GUS）能夠催化4-甲基傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，產生熒光物質4-甲基傘形花酮，以此篩選含gus基因的轉化子。

由于植物細胞GUS本底非常低，因此廣泛地應用于篩選植物轉化子。

尤其是gus基因的3’端與其他結構基因連接產生的嵌合基因仍能正常表達，產生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在轉化生物體中的定位分析。轉化子的篩選基于報告基因篩選克隆子螢火蟲熒光素酶基因（luc）作為報告基因

luc表達產物螢火蟲熒光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以與熒光素和ATP底物發生反應，形成與酶結合的腺苷酸熒光素酰化復合物，經過氧化脫羧作用后，該復合物轉變成為處于激活狀態的氧化熒光素，可以用熒光測定儀快速靈敏地檢測出產生的熒光，是目前研究動植物轉基因很好用的一種報告基因。

Luc基因檢測十分迅速，靈敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測對人體健康和環境生態所造成的危害，也沒有內源熒光產物的背景干擾，因此，Luc是一種理想的報告基因。轉化子的篩選基于報告基因篩選克隆子綠色熒光蛋白基因（gfp）作為報告基因