基因工程的基本操作程序白齊第一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定第二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1.目的基因主要是指：

_______________________編碼蛋白質的結構基因2.獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲取（2）利用PCR技術擴增（3）人工合成一、獲取目的基因第三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五①概念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫（1）從基因文庫中獲取目的基因提取某種生物的全部DNA一定大小的許多DNA片段重組DNA分子(攜帶目的基因)限制酶與載體連接受體細胞(基因文庫)篩選出產生特定性狀的受體細胞導入外源DNA擴增目的基因分離第四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五②種類1.基因組文庫:2.部分基因文庫（如cDNA文庫）基因文庫中包含了一種生物的所有基因,這種基因文庫叫做基因組文庫基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.優點：操作簡單缺點：工作量大，盲目性強③從基因文庫中獲取目的基因第五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五基因組文庫與部分基因文庫的關系第六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五？為什么要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內提取可以嗎？如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段等情況，往往就需要構建基因文庫。如果所需要的目的基因序列已知，可以通過PCR等方式獲得，則不需要構建基因文庫。尋根問底第七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五鞏固訓練1、構建基因組DNA文庫時，首先應分離細胞的（）

A.染色體DNA

B.線粒體DNAC.總mRNA

D.tRNA2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關基因文庫的描述正確的是（）A.某生物的全套基因就是一個基因文庫B.將含有某種生物不同的許多DNA片段，導入某個生物體內，則這個生物就是一個基因文庫C.含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D.含有多種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫AC第八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（2）利用PCR技術擴增目的基因1.PCR——多聚酶鏈式反應是一項生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。通過此技術，可以在短時間內大量擴增目的基因。2.原理：DNA復制要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物3.前提：第九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五四種脫氧核苷酸

一對引物：耐熱的DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

4.條件：與目的基因的起始段互補。5.方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環的次數）6.結果：指數2n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增第十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五7.過程：變性、復性、延伸三步曲①變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA②復性：冷卻至50～60℃兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合③延伸：加熱至70～75℃溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。變性復性延伸第十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五DNA復制PCR技術場所解旋方式溫度條件酶特點結果聯系PCR技術擴增與DNA復制的比較細胞內溫和的條件需控溫,在較高溫度下進行DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復制、邊解旋邊復制半保留復制、全解旋再復制體外細胞內(主要在細胞核內)大量的DNA片段(基因)形成整個DNA分子耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)DNA聚合酶、解旋酶等①模板:均需要

作為模板進行物質合成②原料:均為四種

.

③酶:均需要

進行催化④引物:均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸

脫氧核苷酸DNA聚合酶脫氧核苷酸鏈第十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1.下列有關PCR過程的敘述中不正確的是（）A．變性過程中破壞的是DNA分子內堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現B．復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR與細胞內DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高C鞏固訓練第十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五

2.在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數量增多，可用PCR技術進行人工復制，復制時應給予的條件是()①雙鏈DNA分子為模板

②ATGTG或TACAC模板鏈③四種脫氧核苷酸④四種核苷酸⑤DNA聚合酶⑥熱穩定DNA聚合酶⑦引物⑧溫度變化⑨恒溫

A.①③④⑦⑧⑨

B.①②④⑥⑦⑧

C.①②⑤⑥⑦⑨

D.①③⑥⑦⑧D第十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（3）人工合成1.逆(反)轉錄法2.化學合成法補充：基因的結構非編碼區非編碼區編碼區內含子原核細胞真核細胞外顯子RNA聚合酶結合位點啟動子終止子轉錄終止第十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五真核細胞的基因結構內含子外顯子真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列:有調控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區和內含子編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子編碼區上游編碼區下游第十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五外顯子對應的RNA序列內含子對應的RNA序列成熟的mRNA轉錄編碼區非編碼區非編碼區外顯子內含子真核生物的轉錄過程末成熟的mRNA剪接內含子(有關酶的作用下)第十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五編碼區非編碼區非編碼區DNA聚合酶有關的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉錄酶轉錄剪接逆轉錄復制啟動子終止子基因不含非編碼系列。即不含非編碼區和內含子(以真核生物的逆轉錄過程為例)1.逆(反)轉錄法第十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五求異思維

你能推測出由mRNA反轉錄形成cDNA的過程大致分為哪些步驟嗎？cDNA合成過程是：①反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。②核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。第十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五2.化學合成法蛋白質的氨基酸序列mRNA的核甘酸序列基因的核苷酸序列目的基因DNA合成儀合成推測推測——根據已知的氨基酸序列合成DNADNA合成儀第二十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五一、目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術擴增3、人工合成:逆(反)轉錄法化學合成法種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫課堂小結：（種類最多）（數量最多）（針對性最強）第二十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1、在已知氨基酸序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是()A、化學合成法

B、基因組文庫法C、cDNA文庫法

D、多聚酶鏈式反應2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是()①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術擴增目的基因③反轉錄法④通過DNA合成儀利用化學方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD鞏固訓練第二十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五二、基因表達載體的構建

——基因工程的核心1、目的：①使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。②使目的基因能夠表達和發揮作用。第二十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五二、基因表達載體的構建——核心（1）用一定的_________切割質粒，使其出現一個切口，露出____________。（2）用___________切割目的基因，使其產生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子(重組質粒)限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同2.過程:目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。第二十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五3、基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因e、復制原點啟動子目的基因復制原點終止子標記基因表達載體表達載體的模式圖表達載體第二十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五啟動子目的基因復制原點終止子標記基因表達載體表達載體的模式圖終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，使轉錄終止。標記基因：為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而篩選出含有目的基因的受體細胞。啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質。第二十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五①載體與表達載體的區別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了

、

、

三部分結構②用到的工具酶：既用到

切割載體，又用到

將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是

。③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意：目的基因啟動子終止子限制酶DNA連接酶磷酸二酯鍵第二十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五思考與探究：1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？不可以，因為目的基因在表達載體中得到表達并發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。第二十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1.(多選)一個基因表達載體的構建應包括()A．目的基因B．啟動子

C．終止子D．標記基因2.下列關于基因表達載體的敘述不正確的是()A．啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼B．啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對mRNA的轉錄起調控作用C．標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別ABCDA鞏固訓練第二十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五第三十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五受體細胞具備的條件：

沒有與運載體相同的質粒或沒有與運載體質粒相同的標記基因。三、將目的基因導入受體細胞(一)轉化：(二)方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法(常用)基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+法處理法(感受態細胞法)目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩定表達第三十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1.將目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法第三十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（1）農桿菌轉化法(常用)①農桿菌：

植物的受傷組織會產生一些糖類和酚類物質吸引根瘤農桿菌向受傷組織集中，使植物形成腫瘤。

此糖類和酚類物質主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，農桿菌易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力。思考與探究：2.根據農桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理,你能分析出農桿菌不能將目的基因導入單子葉植物的原因嗎?第三十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（1）農桿菌轉化法

Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。②原理：第三十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五③轉化過程:Ti質粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉入農桿菌第三十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物第三十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（3）花粉管通道法適用于被子植物我國科學家獨創的一種方法,我國的轉基因抗蟲棉就是用這種方法獲得的第三十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五

植物花粉在柱頭上萌發后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。滴加目的基因溶液（3）花粉管通道法第三十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五2.將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？受精卵具有體積大,易操作,經培養可直接表達性狀的優點。而動物體細胞的全能性受限。第三十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（2）操作程序:提純含目的基因表達載體受精卵顯微注射移植到子宮新性狀動物早期胚胎培養2.將目的基因導入動物細胞第四十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五常用法：Ca2+處理細胞法

(Ca2+增加細菌細胞的通透性)常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA3.將目的基因導入微生物細胞細菌能夠吸收DNA的狀態第四十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1、基因工程中科學家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是（）

A．結構簡單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質含量少、簡單D．性狀穩定、變異少2、基因工程常用的受體細胞有（）①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動植物細胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3、基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的，在基因操作的基本步驟中,不進行堿基互補配對的步驟是()A.人工合成基因B.目的基因與運載體結合C.將目的基因導入受體細胞D.目的基因的檢測和表達C鞏固訓練第四十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是()①將毒素蛋白質注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中④將編碼毒素蛋白的DNA序列與質粒重組，導入細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養A．①②B．②③C．③④D．①④C5.下列屬于基因工程中導入目的基因方法的是()①農桿菌轉化法②基因槍法③花粉管道法④顯微注射法⑤胚胎移植⑥DNA分子雜交法A．①②③④⑤⑥B．①②③④⑤C．①②③④D．①③④⑤⑥C第四十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功(一)分子水平檢測(二)個體水平鑒定1.檢測轉基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因2.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定,抗病鑒定,活性鑒定等方法：DNA分子雜交(DNA和DNA)方法：分子雜交(DNA和mRNA)方法：抗原-抗體雜交第四十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因。①首先取出轉基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:②

將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③

使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）分子檢測第四十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第四十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五DNA附著在膜上硝酸纖維素膜加探針報告基因（含熒光素分