椒目油對豚鼠哮喘模型肥大細胞和類胰蛋白酶的影響【摘要】目的：探討椒目油對豚鼠哮喘模型肺組織中肥大細胞及血漿類胰蛋白酶的影響，為ZSO治療哮喘提供理論依據.方法：實驗分為4組：對照組，哮喘模型組，地塞米松治療組和ZSO治療組.用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏和霧化吸入激發建立哮喘豚鼠模型.鏡下觀察肺組織肥大細胞數量及脫顆粒現象.運用UniCAP100全自動體外變應原檢測儀測定豚鼠血漿類胰蛋白酶含量.結果：哮喘模型組豚鼠肺高倍視野肥大細胞數、脫顆粒百分率及血漿類胰蛋白酶含量分別為,,，與對照組,,相比均升高，差異有統計學意義(P＜).ZSO治療組豚鼠肺高倍視野肥大細胞數、脫顆粒百分率及血漿類胰蛋白酶含量分別為,,,與地塞米松治療組豚鼠肺高倍視野肥大細胞數、脫顆粒百分率及血漿類胰蛋白酶含量分別為,,,與哮喘模型組相比顯著降低，差異有統計學意義(P＜).ZSO與地塞米松兩治療組之間上述指標相比差異均無統計學意義(P＞).結論：ZSO能有效地減少哮喘豚鼠肺肥大細胞數量，抑制肥大細胞脫顆粒、釋放類胰蛋白酶，從而能有效地治療哮喘.

【關鍵詞】椒目油；哮喘；肥大細胞；類胰蛋白酶

支氣管哮喘是一種復雜的慢性呼吸道炎癥，哮喘患者氣道平滑肌可見大量肥大細胞浸潤并呈脫顆粒狀態［1］.肥大細胞特有的類胰蛋白酶是肥大細胞脫顆粒的標志物，具有增高氣道反應性、促進炎癥細胞聚集及刺激多種細胞增殖［2］的作用，已成為哮喘研究的一大熱點.中藥椒目治療哮喘歷史悠久，療效顯著，但其作用機制尚不清楚.我們通過探究椒目油對豚鼠哮喘模型肥大細胞及其所釋放的類胰蛋白酶的作用，揭示椒目治療哮喘的作用機制，為ZSO的臨床應用提供理論依據.

1材料和方法

材料健康雄性豚鼠36只，體質量(250±50)g購于第四軍醫大學實驗動物中心；ZSO由第四軍醫大學西京醫院藥劑科提供；卵白蛋白購于美國Sigma公司；401AI超聲霧化器購于上海魚躍醫療設備有限公司；UniCAP100全自動體外變應原檢測儀為瑞典PHARMACIA公司產品；UniCAPTryptase試劑盒購于瑞典PHARMACIA公司.

方法

豚鼠哮喘模型的建立按參照文獻［3］的方法操作.即豚鼠腹腔注射含有100g/LOVA及100g/L氫氧化鋁凝膠的生理鹽水1mL致敏，第15日用10g/LOVA溶液超聲霧化激發，每日1次，連續7d.每次激發直到豚鼠出現咳嗽、呼吸急促，腹肌緊張等哮喘癥狀為止.

實驗分組及處理將豚鼠隨機分為4組：對照組、哮喘模型組、地塞米松治療組和ZSO治療組，每組9只.對照組用等量生理鹽水注射和霧化吸入;哮喘模型組用OVA致敏激發;地塞米松治療組致敏激發方法同哮喘模型組，但激發后立即給予5g/L地塞米松溶液霧化吸入5min;ZSO治療組致敏方法同哮喘模型組，激發后立即給予ZSO以3mL/kg灌胃.

類胰蛋白酶測定各組豚鼠末次激發后，從心臟直接抽血5mL，立刻置入含EDTA的抗凝管中混勻，靜置30min后以1500r/min離心10min，留取血漿凍存于-80℃.運用UniCAP100全自動體外變應原檢測儀及UniCAPTryptase試劑盒測定血漿中類胰蛋白酶的含量.

細胞形態學觀察放血處死動物，取右肺下葉相同部位組織石蠟包埋切片，行HE和Giemsa染色［4］.Giemsa染色后于低倍鏡下選擇特殊染色陽性的細胞相對密集區，計數9個高倍視野中的肥大細胞總數，計算每個高倍視野中的平均細胞數.計算肥大細胞脫顆粒百分率.

統計學處理：所有數據均以x±s表示.將原始數據輸入SPSS統計軟件包，方差齊同，組間比較運用LSDt檢驗；方差不齊，采用非參數方法進行組間比較.

2結果

模型動物大體表現哮喘模型組豚鼠在誘喘過程中出現哮喘發作癥狀，不同程度地表現為咳嗽、呼吸急促、腹肌緊張、四肢軟癱、行動遲緩或抽搐跌倒，約30min后癥狀逐漸緩解.ZSO治療組和地塞米松治療組豚鼠激發后所表現癥狀的程度較同期哮喘模型組明顯減弱，約5～10min后癥狀緩解或消失.

染色病理學表現哮喘模型組豚鼠肺外觀體積增大，表面略腫脹，有不規則暗紅色充血區及多處小米粒大小的紅色出血點，支氣管和肺泡腔內黏液分泌明顯增多.其肺組織病理切片HE染色顯示：支氣管壁及支氣管周圍組織有多處紅細胞聚集區，且有大量炎細胞浸潤，包括淋巴細胞、嗜酸粒細胞、單核細胞等；氣道黏膜上皮增厚，氣道變窄，嚴重者可見脫落.上述病理變化證明哮喘模型建立成功.ZSO治療組豚鼠肺大體表現：體積無明顯變化，表面充血區及出血點有明顯吸收的痕跡，面積明顯小于哮喘組，出血點數量也明顯減少；切片表現為小氣道及肺泡壁結構完整，支氣管和肺泡腔內分泌物顯著減少，肺組織炎性細胞浸潤明顯減少，無氣道狹窄及氣道上皮細胞脫落等現象.地塞米松治療組病理變化與ZSO治療組相似，但炎性細胞的減少沒有ZSO治療組明顯.

染色肥大細胞的形態學觀察高倍鏡下觀察肥大細胞多沿血管及細

支氣管分布，尤以細支氣管周圍聚集顯著，肺間質亦有少量散在分布.經Giemsa染色后肥大細胞顆粒成紫紅色，細胞質為藍色.與對照組相比，哮喘模型組肺組織肥大細胞數量較多，體積較小，胞質內顆粒較少，成弱堿性，細胞境界模糊，成桑葚狀，在細胞周圍的細胞間質中可見肥大細胞顆粒，細支氣管管徑收縮明顯，管腔內有較多絲狀分泌物，管壁內有多種炎癥細胞浸潤.ZSO治療組及地塞米松治療組肺組織肥大細胞呈橢圓形或圓形，數量較模型組明顯減少，體積較大，細胞膜光滑完整，少數成脫顆粒狀.

豚鼠肺肥大細胞及血漿類胰蛋白酶含量比較哮喘模型組與對照組相比較，其肺組織高倍視野肥大細胞數、脫顆粒百分率明顯升高，差異有統計學意義(P＜)；ZSO和地塞米松兩治療組與哮喘模型組相比降低，差異有統計學意義，與對照組比較差異無統計學意義(P＞).ZSO治療組與地塞米松治療組比較差異無統計學意義(P＞).ZSO和地塞米松兩治療組類胰蛋白酶含量較哮喘模型組均降低，差異有統計學意義(P＜)，與對照組相比差異無統計學意義(P＞)；ZSO與地塞米松兩治療組間類胰蛋白酶含量比較均差異無統計學意義(P＞，表1).

3討論

哮喘的發病機制非常復雜，目前被認為與Ⅰ型變態反應密切相關，而肥大細胞是介導Ⅰ型變態反應的重要成分之一.肥大細胞脫顆粒所釋放的類胰蛋白酶能高效誘導中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤、持續A：對照組；B：哮喘模型組；C：椒目油治療組；D：地塞米松治療組.表1各組豚鼠肥大細胞數、脫顆粒百分率及類胰蛋白酶含量比較性增加微血管通透性、刺激上皮細胞釋放IL8，上調細胞間黏附分子的表達、促進氣道組織纖維化［5］，而炎癥性細胞募集、血管通透性增加和ICAM1高表達［6］是哮喘炎癥的主要特征，因此推測類胰蛋白酶在哮喘炎癥的發生、發展和氣道重建中起促進作用［7］.

本實驗中發現，ZSO能顯著降低哮喘豚鼠肺組織中肥大細胞數量、脫顆粒百分率及血漿類胰蛋白酶含量，從而減輕哮喘發展過程中引起的肺組織充血水腫、炎性細胞浸潤甚至出血壞死等病理改變，這表明ZSO能夠抑制肥大細胞脫顆粒及類胰蛋白酶誘導的諸多異常改變，從而達到治療哮喘的目的.

椒目治療哮喘在我國歷史悠久，歷代名醫用椒目單方或復方治療哮喘，取得了很好療效［8］.我們研究ZSO治療哮喘的機制，為椒目治療哮喘提供藥理學基礎.由于ZSO富含Ca，Mg，Fe，Zn，Sr和Mn等人體必須的礦物質，同時還具有適用范圍廣、起效時間短、維持時間長、副作用少、來源廣泛及價格低廉等優點，因此作為一種新型哮喘治療藥物，ZSO具備良好的開發前景.

【參考文獻】

［1］RobinsonDS.Theroleofthemastcellinasthma:Inductionofairwayhyperresponsivenessbyinteractionwithsmoothmuscle［J］.JAllergyClinImmunol,2004,114(6):58-65.

［2］BraddingP.Theroleofthemastcellinasthma:Areassessment［J］.CurrOpinAllergyClinImmunol,2003,3(1):45-50.

［3］劉春濤.氣道炎癥性疾病［M］.北京：人民衛生出版社,2004:506-507.

［4］趙一嶺，黃高升，李玉松，等.改良微波姬姆薩染色法在病理診斷中的應用體會［J］.臨床與實驗病理學雜志,1998,14(2)：194-195.

［5］SchwartzLB.Clinicalutilityoftryptaselevelsinsystemicmastocytosisandassociatedhematologicdisorders［J］.LeukRes,2001,25(7):553-562.

［6］BruceSB,WilliamWB.Advancesinmechanismsofallergy［J］.JAlle