資料內容僅供您學習參考，如有不當之處，請聯系改正或者刪除。目的規范微生物限度檢驗操作,確保檢驗結果準確、可靠。依據《中國藥典》。范圍本標準適用于微生物限度檢驗。責任中心化驗室負責人:對本規程的實施負責。中心化驗室檢驗人員:嚴格按照本規程執行檢驗操作。程序執行標準:《中國藥典》。抽樣:照《取樣標準操作規程》進行。6內容6.1需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數計數方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數法(MPN法)。檢查時,按已驗證的計數方法進行供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定。6.1.1設備、儀器及用具6.1.1.1設備微生物限度檢測室、凈化工作臺、生化培養箱(30～350C)、生化培養箱(20～250C)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、脈動真空滅菌柜、紫外燈等。6.1.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養皿、量筒、試管及塞、移液槍及吸頭、薄膜過濾器等。6.1.1.3用具大、小橡皮乳頭,潔凈工作服、口罩、醫用手套、接種環、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.1.2試液6.1.2.1消毒液A．0.1%新潔爾滅溶液B．75%乙醇溶液6.1.2.2稀釋液、試劑及配制A．pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液:取磷酸二氫鉀3.56g、無水磷酸氫二鈉5.77g、氯化鈉4.3g、蛋白胨1.0g,加純化水1000ml,微溫溶解,濾清,分裝,1210C滅菌15分鐘。B．聚山梨酯80C．無菌十四烷酸異丙酯D．pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液6.1.3培養基胰酪大豆胨瓊脂培養基、胰酪大豆胨液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基6.1.4操作方法6.1.4.1試驗前準備6.1.4.1.1將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、試管、移液槍吸頭(1ml、10ml)、量筒、稀釋液、培養基等移至傳遞窗內。每次試驗所用物品必須事先計劃,準備足夠用量,避免操作中出入操作間。6.1.4.1.2開啟微生物檢測室紫外燈和空調凈化系統,并使其工作不低于30min。6.1.4.1.3操作人員進入一更,用洗手液或肥皂洗手,烘干。進入二更,用0.1%新潔爾滅溶液洗手,穿戴潔凈無菌服、口罩、手套。6.1.4.1.4操作前先用乙醇棉球擦手,再用乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍,待干后用滅菌的手術鑷或剪將供試品啟封。6.1.4.2供試液的制備根據供試品的理化特征與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1小時。常見的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經確認均不適用,應建立其它適宜的方法。6.1.4.2.1水溶性供試試品取供試品,用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養基溶解或稀釋制成1:10供試液。若需要,調節供試液pH值至6～8。必要時,用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。6.1.4.2.2水不溶性非油脂類供試品取供試品,用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養基溶解或稀釋制成1:10供試液。分散力較差的供試品,可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1﹪的聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要,調節供試液pH值至6～8。必要時,用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。6.1.4.2.3油脂類供試品取供試品,加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解,或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其它無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40℃(特殊情況下,最多不超過45℃),小心混合,若需要可在水浴中進行,然后加入預熱的稀釋液使成1:10供試液,保溫,混合,并在最短時間內形成乳狀液。6.1.4.2.4腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品10g,加入pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液,置45℃水浴中,振搖,使溶解,制成1:10的供試液。6.1.4.3供試液的稀釋取1:10均勻供試液1ml,加入裝有9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中混勻,即為1:100供試液。以此類推,根據供試品污染程度,可稀釋至1:1000、1:10000等適宜稀釋級。每遞增1稀釋劑,必須另換一支吸管。6.1.4.4檢查法6.1.4.4.1檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量(g、ml、cm2)。一般應隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品,混合,取規定量供試品進行檢驗。除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g或10ml;膜劑為100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量能夠酌減。檢驗時,應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品。6.1.4.4.2平皿法6.1.4.4.2.1取規定量供試品,按方法適用性試驗確認的方法進行供試液的制備和菌數測定,每稀釋級每種培養至少制備2個平板。6.1.4.4.2.2陰性對照以稀釋液代替供試液進行陰性對照試驗,陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長,應進行偏差調查。6.1.4.4.2.3傾注培養基將預先配制好的培養基(需氧菌總數計數用胰酪大豆胨瓊脂培養基,霉菌和酵母菌總數計數用沙氏葡萄糖瓊脂培養基)熔化,置45。C水浴中,備用。將45。C左右的瓊脂傾注上述各個平皿約15ml,以順時針或反時針方向快速轉動平皿(勿使培養基溢出)使供試液與培養基混勻,放置,待凝。6.1.4.4.2.4培養和計數需氧菌總數計數平板倒置于30～35℃培養箱中培養3～5天。霉菌和酵母菌總數計數平板倒置于20～25℃培養箱中培養5～天,必要時可延長至7天。觀察菌落生長情況,點計平板上生長的所有菌落數,計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后,計算各稀釋級供試液的平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小于15,則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。6.1.4.4.2.5菌數報告規則需氧菌總數測定宜選取平均菌落數小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數測定宜選取平均菌數小于100cfu的稀釋級,作為菌數報告的依據。以最高的平均菌落數,計算1g、1ml或10cm2供試品中所含的微生物,取兩位有效數字報告。如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數小于1時,以＜1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。6.1.4.4.3薄膜過濾法6.1.4.4.3.1薄膜過濾法所采用濾膜孔徑應不大于0.45μm,直徑約為50mm,若采用其它直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后,若需要沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為100ml。總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。6.1.4.4.3.2取相當于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾。若供試品所含的菌數較多時,可取適宜稀釋級的供試液1ml,過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其它適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上是不得有空隙或氣泡,否則影響微生物的生長。6.1.4.4.3.3陰性對照取試驗用的稀釋液1ml照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。6.1.4.4.3.4培養和計數培養條件和計數方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數應不超過100cfu。6.1.4.4.3.5菌數報告規則以相當于1g或1ml供試品的菌落數報告菌數;若濾膜上無菌落生長,以<1報告菌數(每張濾膜過濾1g或1ml供試品),或<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。6.1.4.4.4MPN法MPN法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿法,僅在供試品需氧菌總數沒有適宜計數方法的情況下使用,本法不適用霉菌計數。取供試液至少3個連續稀級,每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有9～10ml胰酪大豆胨液體培養基中。必要時可在培養基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置30～35℃培養3天,逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原因使得結果難以判斷,可將該管培養物轉種至胰酪大豆胨液體培養基或胰酪大豆胨瓊脂培養基,在相同條件下培養1～2天,觀察是否有微生物生長。根據微生物生長的管數從表1查被測供試品每1g或1ml中需氧菌總數的最可能數。表1微生物最可能數檢索表生長管數需氧菌總數最可能數95﹪置信限每管含樣品的g或ml數MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000〈309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.535201144352022053821015438211205382122799422021540221289942223599423029994231369943002359430138910430264161813104391813117517199312120303603131603038032093183603211503038032221030400323290909903302404099033146090198033211002004000333〉11006.1.4.4.5結果判斷需氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基上生長的總菌落數(包括真菌菌落數);霉菌和酵母菌總數是指沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的總菌落數(包括細菌菌落數)。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的細菌使霉菌和酵母菌的計數結果不符合微生物限度要求,可使用含抗生素(如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂培養基或其它選擇性培養基(如玫瑰紅鈉瓊脂培養基)進行霉菌和酵母菌總數測定。使用選擇性培養基時,應進行培養基適用性檢查。若采用MPN法,測定結果為需氧菌總數。若供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的檢查結果均符合該品種項上的規定,判供試品符合規定;若基中任何一項不符合該品種項下的規定,判供試品不符合規定。控制菌檢查控制菌檢查法系用于在規定的試驗條件下,檢查供試品中是否存在物定的物生物。當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應的微生物限度標準時,應按下列規定進行檢驗、包括樣品取樣量和結果判斷等。供試品檢出控制菌或其它致病菌時,按一次檢出結果為準,不再復試。供試液制備及實驗環境要求同需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數應為內容,這個羅列成子項。應為內容,這個羅列成子項如果供試品具有抗菌活性,應盡可能去除或中種。供試品檢查時,若使用了中和劑或滅活劑,應確認有效性及對微生對無毒性。供試液制備如果使用了表面活性劑,應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查,對照菌的加量應不大于100cfu。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照試驗:以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查法檢查,陰性對照試驗應無菌生長,如陰性對照有菌生長,應進行偏差調查。6.2大腸埃希菌6.2.1設備、儀器及用具6.2.1.1設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養箱(30～350C、42～440C)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.2.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.2.1.3用具大、小橡皮乳頭,潔凈工作服、口罩、醫用手套、接種環、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.2.2試液指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液、革蘭染色液、碘液、95%乙醇。6.2.3培養基胰酪大豆胨液體培養基、麥康凱瓊脂培養基、麥康凱液體培養基等。6.2.4操作方法6.2.4.1供試液制備和增菌培養取供試品,照”6.1.4.2”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試液,接種至適宜體積(經方法適用性試驗確定)的胰酪大豆胨液體培養基中,混勻,在30～35℃培養18～24小時。6.2.4.2選擇和分離培養取上述培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中,42～44℃培養24～48小時。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上,30～35℃培養18～72小時。6.2.4.3結果判斷若麥康凱瓊脂培養基平板上有菌落生長,應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗,確證是否為大腸埃希菌;若麥康凱瓊脂培養基平板上沒有菌落生長,或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌。6.2.4.4若麥康凱瓊脂培養基平板上有菌落生長,應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗。以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心,沾取培養物,應挑選2～3個以上疑似菌落,分別接種營養瓊脂斜面,培養18～24小時,作以下檢查。6.2.4.4.1革蘭染色、鏡檢以接種環沾取無菌水于潔凈載玻片上,取上述疑似菌落的營養瓊脂斜面新鮮培養物少許,制成均勻涂片,自然或微溫干燥,再經過火焰2～3次(載玻片不燙手)固定。滴加結晶紫染液,染色1min,水洗,滴加碘液,媒染1min,水洗,以濾紙吸干余水。滴加95%乙醇,脫色20～30s,水洗。滴加沙黃染液,復染1min,待干后,鏡檢。6.2.4.4.2染色結果革蘭陽性菌呈藍紫色;革蘭陰性菌呈紅色,大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌,或球桿菌狀,亦有桿菌狀。6.2.4.4.3注意事項6.2.4.4.3.1玻片必須潔凈,涂片菌量宜少,菌不可濃。否則,菌細胞成堆或連成片。染色反應難于判斷,菌細胞形態難于觀察。6.2.4.4.3.2培養物的菌齡以16-24h為宜。培養時間過長的革蘭陽性菌易染成紅色。6.2.4.4.3.3脫色是關鍵,脫色時間不足,菌細胞易染成陽性,脫色時間過長易染成陰性。6.3耐膽鹽革蘭陰性菌6.3.1設備、儀器及用具6.3.1.1設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養箱(30-350C)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.3.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.3.1.3用具大、小橡皮乳頭,潔凈工作服、口罩、醫用手套、接種環、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.3.2試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.3.3培養基胰酪大豆胨液體培養基、腸道菌增菌液體培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基等6.3.4操作方法6.3.4.1供試液制備和預培養取供試品,用胰酪大豆胨液體培養基作為稀釋劑照”6.1.4.2”制成1:10供試液,混勻,在20～25℃培養,培養時間應使供試品中的細菌充分恢復但不增殖(約2小時)。6.3.4.2定性試驗除另有規定外,取相當于1g或1ml供試品的上述預培養物接種至適宜體積(經方法適用性試驗確定)腸道菌增菌液體培養基中,30℃～35℃培養24～48小時后,劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上,30℃～35℃培養18～24小時。如果平板上無菌落生長,判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。6.3.4.3定量試驗6.3.4.3.1選擇和分離培養取相當于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml、0.001ml)供試品的預培養物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經方法適用性試驗確定)腸道菌增菌液體培養基中,30℃～35℃培養24～48小時。和述每一培養物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養平板上,30℃～35℃培養18～24小時。6.3.4.3.2結果判斷若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上有菌落生長,則對應培養管為陽性,否則為陰性。根據各培養管檢查結果,從表2查1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數。表2耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(N)各供試品量的檢出結果每1g(或1ml)供試品中可能的菌數cfu0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml＋＋＋－＋＋－－＋－－－N＞103102＜N＜10310＜N＜102N＜10注:(1)+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長;—代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生長。(2)若供試品量減少10倍(0.01g或0.01ml,0.001g或0.001ml,0.0001g或0.0001ml),則每1g(或1ml)供試品中可能的菌數(N)應相應增加10倍。6.4沙門菌6.4.1設備、儀器及用具6.4.1.1設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養箱(30-350C)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.4.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.4.1.3用具大、小橡皮乳頭,潔凈工作服、口罩、醫用手套、接種環、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.4.2試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.4.3培養基胰酪大豆胨液體培養基、RV沙門菌增菌液體培養基、木糖賴氨酸脫氧酸鹽瓊脂培養基、三糖鐵瓊脂培養基等。6.4.4操作方法6.4.4.1供試液制備和增菌培養取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積(經方法適用性試驗確定)的胰酪大豆胨液體培養基中,混勻,30～35℃培養18～24小時。6.4.4.2選擇和分離培養取上述培養物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養基中,30～35℃培養24～48小時。取少量RV沙門增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上,30～35℃培養18～48小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上生長良好,菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種,培養18～48小時,或采用基她適宜方法進一步鑒定。6.4.4.3結果判斷若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上有疑似菌落生長,且三糖鐵瓊脂培養基的斜面為紅色、底層為黃色,或斜面黃色、底層黃色或黑色,應進一步進行適宜的鑒定試驗,確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長,或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性,或三糖鐵瓊脂培養基的斜面未見紅色、底層未見黃色;或斜面黃色、底層未見黃色或黑色,判供試品未檢出沙門菌。6.5銅綠假單胞菌6.5.1設備、儀器及用具6.5.1.1設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養箱(30-350C)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.5.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.5.1.3用具大、小橡皮乳頭,潔凈工作服、口罩、醫用手套、接種環、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.5.2試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.5.3培養基胰酪大豆胨液體培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基等。6.5.4操作方法6.5.4.1供試液制備和增菌培養取供試品,照”6.1.4.2”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試液,接種至適宜體積(經方法適用性試驗確定)的胰酪大豆胨液體培養基中,混勻,在30～35℃培養18～24小時。6.5.4.2選擇和分離培養取上述培養物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上,30～35℃培養18～72小時。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗,或采用其它適宜方法進一步鑒定。6.5.4.3氧化酶試驗取潔凈濾紙片置于平皿內,用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上,滴加新配制的1%二鹽酸N,N二-甲基對苯二胺試液,在30秒內若培養物呈粉紅色并逐漸變為紫紅色為氧化酶試驗陽性,否則為陰性。6.5.4.4結果判斷若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上有菌落生長,且氧化酶試驗陽性,應進一步進行適宜的鑒定試驗,確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長,或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性,或氧化酶試驗陰性,判供試品未檢出銅綠假單胞菌。6.6金黃色葡萄球菌6.6.1設備、儀器及用具6.6.1.1設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養箱(30-350C)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.6.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.6.1.3用具大、小橡皮乳頭,潔凈工作服、口罩、醫用手套、接種環、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.6.2試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.6.3培養基胰酪大豆胨液體培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基等。6.6.4操作方法6.6.4.1供試液制備和增菌培養取供試品,照”6.1.4.2”制成1:10供試液。取相當于1g或1ml供試液,接種至適宜體積(經方法適用性試驗確定)的胰酪大豆胨液體培養基中,混勻。在30～35℃培養18～24小時。6.6.4.2