微生物的分離與純化實驗目的、要求（1）學習微生物的分離技術。（2）學習從樣品中分離、純化出所需菌株。（3）學習平板菌落計數法。以細菌為例實驗原理純種分離技術分離：從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純種的方法。純種（純培養）：一個菌落或一個培養物中所有的細胞是由一個細菌（或細胞）分裂繁殖而產生的后代。

微生物的分離與純化技術的應用：分離具有特殊功能的微生物、優良菌種及純化被污染的菌種等。

土壤是微生物的大本營，混雜著大量的微生物，從中分離可得到只含有這一種微生物的純培養。分離純化：菌種被其他雜菌污染或混合菌懸液常要進行分離純化；方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法兩種。

要獲得某種微生物的純種，還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養基及培養條件。

細菌常用牛肉膏蛋白胨培養基，在30-37℃溫度下培養1-2天。

平板菌落計數——活菌計數0.90.10.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.9ml分離純化基本流程實驗儀器、材料實驗材料菌源:土樣10g;培養基牛肉膏蛋白胨培養基;實驗儀器與用具1)超凈工作臺、恒溫培養箱、酒精燈2）1000ul及100ul移液槍、1000ul及100ul槍頭、無菌1.5ml的離心管、離心管架3）無菌平皿、涂布器、接種環實驗試劑:無菌水;實驗內容1、土樣取樣:

選擇肥沃土壤,去表層土,挖3－8cm深度的土壤數10g,裝入已滅菌的牛皮紙袋,封好袋口,帶回實驗室。2、制備土壤稀釋液：

稱取土樣1.0g，放入盛99ml無菌水的三角瓶中，置搖床振蕩20min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-2）。用100ul移液槍從中吸取100ul土壤懸液，注入事先分裝有900ul無菌水的離心管中，吹吸3次，振蕩均勻（10-3）。然后同樣方法，配置成稀釋度為10-4，10-5的土壤菌懸液。3、分離

稀釋涂布平板法用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養基平板上，用灼燒冷卻后的無菌涂布器涂勻。每個濃度做3個平板（重復）。注意：無菌操作；用槍頭吸取菌懸液時注意“吹打數次”確保混勻。4、培養待平板上液體被完全吸收，將平板倒置于370C溫箱中培養24h；5、菌落計數

含菌樣品的微生物經稀釋分離培養后，每一個活菌細胞可在平板上繁殖形成一個肉眼可見的菌落，故可據平板上菌落的數目推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數（菌落形成數目）。

選擇平均菌落數在30~300間的平板，求其平均值。

每克含菌樣品中微生物的活細胞數（菌落形成數（同一稀釋度平板上菌落平均數×10×稀釋倍數）/含菌樣品克數菌落計數規則：選擇平均菌落數在30~300間的平板1、只有一個稀釋度符合，則以該稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數；2、有兩個稀釋度符合，取決于二者比值（高稀釋度的菌落數除以低稀釋度的菌落數的值）：1）若0.5≤比值≤2，以兩稀釋度的菌落數乘稀釋倍數所得的值的均值。2）若2≤比值或比值≤0.5，則取其中較少的菌落總數。

3、若所有稀釋度的菌落平均數均大于300，則按稀釋倍數最高的平均菌落數乘以稀釋倍數；4、若所有稀釋度的菌落平均數均小于30，則按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；所有菌落數均不在30~300間以最接近30或300的平均菌落數乘稀釋倍數6、平板劃線法挑取單個菌落（細菌菌落），分別在平板上做分區和劃線。370C培養48h檢查菌落是否單純。無菌操作（近火焰處操作）：劃線方法：：灼燒、冷卻、取菌區1劃線灼燒、冷卻區2劃線區3劃線