學(xué)習(xí)情境3

微生物酶發(fā)酵制藥技術(shù)酶的化學(xué)修飾

酶的化學(xué)修飾

什么是酶化學(xué)修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶化學(xué)修飾的意義提高酶的活力；增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；降低或消除酶的抗原性；研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響酶分子的修飾方法

大分子修飾酶的表面化學(xué)修飾小分子修飾交聯(lián)修飾固定化修飾非催化活性基團(tuán)的修飾蛋白主鏈的修飾酶分子內(nèi)部修飾催化活性基團(tuán)的修飾輔助因子的修飾肽鏈伸展的修飾結(jié)合定點(diǎn)突變的修飾1.酶的表面化學(xué)修飾（1）大分子修飾可溶性大分子通過共價(jià)鍵連接在酶分子表面，形成覆蓋層。應(yīng)用最廣泛的是：PEG類修飾，分子量為500-20000。（2）小分子修飾利用分子化合物對酶的活性部位或活性部位之外外的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，以改變酶學(xué)性質(zhì)。廣泛使用的小分子化合物有：氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸等。（3）交聯(lián)修飾使用雙功能試劑，如戊二醛、PEG等將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，可提供其穩(wěn)定性，增加其在水溶液中的使用價(jià)值。（4）固定化修飾通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上后，由于酶所處的微環(huán)境改變，會(huì)使酶的性質(zhì)發(fā)生改變。2.酶分子內(nèi)部修飾（1）非催化活性基團(tuán)的修飾最經(jīng)常修飾的殘基可以是親核的，也可以是親電的，或是可氧化的。修飾后酶的催化動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。（2）蛋白主鏈的修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。蛋白主鏈修飾主要靠酶法。如：將豬胰島素轉(zhuǎn)變成人胰島素。（3）催化活性基團(tuán)的修飾對催化活性基團(tuán)可以通過選擇性修飾側(cè)鏈成分來實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代。（4）輔助因子的修飾有以下三個(gè)方面①不是共價(jià)結(jié)合的輔助因子，可將輔助因子共價(jià)結(jié)合到酶上；引入新的或修飾過的輔助因子；②將新的輔酶引入結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚的蛋白質(zhì)上；③金屬酶中金屬離子的取代。3.結(jié)合定點(diǎn)突變的化學(xué)修飾現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。酶修飾后的性質(zhì)變化1.熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。2.各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。3.抗原性：比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。4.半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。5.最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。6.Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。7.對組織分布能力改變：一些酶經(jīng)修飾后，對組織的分布能力有所改變，能在血液中被靶器官選擇性吸收。項(xiàng)目3

生產(chǎn)工藝過程1213固定化酶產(chǎn)品介紹氨基酰化酶：這是世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶，可以用于生產(chǎn)各種L-氨基酸藥物。1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，將L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸經(jīng)過消旋化，生成DL-乙酰氨基酸．再進(jìn)行拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60％左右。14固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸乙酰-DL－Ala

L－Ala+乙酰-D－AlaAminoacylase氨基酰化酶15泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子DEAE-葡聚糖－氨基酰化酶晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala16(2)天門冬氨酸酶：1973年日本用聚丙烯酰胺凝膠為載體，將具有高活力天門冬氨酸酶的大腸桿菌菌體包埋制成固定化天門冬氨酸酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)，將延胡索酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天門冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜膠為載體制備固定化酶，也可將天門冬氨酸酶從大腸桿菌細(xì)胞中提取分離出來，再用離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)。17(3)天門冬氨酸脫羧酶：將含天門冬氨酸脫羧酶的假單胞菌菌體，用凝膠包埋法制成固定化天門冬氨酸脫羧酶，于1982年用于工業(yè)化生產(chǎn)，催化L-天門冬氨酸脫去羧基，生產(chǎn)L-丙氨酸。18(4)青霉素酰化酶：是在藥物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的一種固定化酶。可用多種方法固定化。1973年已用于工業(yè)化生產(chǎn)，用于制造各種半合成青霉素和頭孢菌素。用同一種固定化青霉素酰化酶，只要改變pH等條件，就既可以催化青霉素或頭孢菌素水解生成6一氨基青霉烷酸(6一APA)或7一氨基頭孢霉烷酸(7一ACA)，也可以催化6一APA或7一ACA與其他的羧酸衍生物進(jìn)行反應(yīng)，以合成新的具有不同側(cè)鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素。19固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素酰化酶與抗生素改造202122E.Coli斜面細(xì)胞固定化細(xì)胞青霉素G轉(zhuǎn)化液