魚類多倍體育種技術及應用第1頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四自1945年Svrdson首先發現鮭科魚類中存在多倍體類型起，在做過染色體研究的1600多種天然魚類中，人們發現多倍體魚類至少有150種(或亞種)以上。第2頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四黑龍江流域與西伯利亞的銀鯽的某些種群為三倍體種群；河南省的淇河鯽、美國的溪紅點鮭等也是天然三倍體；日本的四倍體關東鯽和大泥鰍也是天然種群；第3頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四人工多倍體是用人工的方法誘導形成的，通過多倍體育種可培育出新的品種，是現代育種的一種新方法，目前已在生產上廣泛應用。第4頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四多倍體魚類與二倍體魚類不同的特性：生長快、個體大、性腺發育異常、壽命延長和遺傳特性改變等。第5頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四可概括為：1）巨型性：細胞容積大于二倍體，因此個體較大；2）速生性：生長快，提前達到商品魚的規格（營養體的生理性旺盛，不能等同于發育快）。水生所的三倍體鯉生長快于雜交鯉，因此三倍體鯉不僅有二倍體雜交鯉的雜交優勢，而且生長速度超過二倍體。第6頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四3）克服遠緣雜交不育性：異源多倍體能大大提高遠緣雜交的受孕性，異源多倍體的后代基本上沒有分離現象。用多倍體魚類作雜交親本，所產的雜種優勢比用二倍體魚類作親本時維持的時間要長。第7頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四4）增強抗逆性：一般多倍體魚的抗病性、耐寒性比相同的二倍體魚類要強。5）生理生化方面的變化明顯：用藥物處理，經過誘變所得的異源多倍體的蛋白質含量顯著提高。當然也存在著一些不足：如某些種類制種和大批量生產有難度，規?；a的成本問題等。第8頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四顯然，這些特性如果能為生產所用的話將有利于提高養殖產量和效益，因此了解和掌握魚類多倍體育種技術具有十分現實的意義。第9頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四魚類和蝦蟹類的多倍體可以采用物理和化學的方法由人工誘導而成。目前利用染色體組操作技術生產人工多倍體水產經濟動物的研究已取得令人矚目的成就。第10頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四已有20余種海洋經濟貝類、近10種十足類甲殼動物如中國對蝦Penaeuschinensis、日本絨螯蟹Eriocheirjaponicus中華絨螯蟹Eriocheirchinensis以及40余種魚進行過人工誘導多倍體的研究并獲得了成功。第11頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四魚類人工多倍體的研究--20世紀70年代后得到迅猛發展。三棘刺魚、鰈、川鰈、大菱鲆、鯉魚、鰱、虹鱒、鳙、白鯽等20多種魚類中獲得多倍體試驗魚。海水魚僅進行了黑鯛、牙鲆三倍體，真鯛三倍體、四倍體等的基礎研究。第12頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四本課程擬對魚類多倍體產生的機制、人工誘導方法、性狀及應用前景作一綜合性介紹。第13頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四1魚類多倍體產生的機制原理：細胞正常的有絲分裂特點：當細胞進行有絲分裂時，染色體組經過復制加倍，被紡錘絲拉向兩極，中間形成隔膜，使一個細胞分裂變成染色體組與原來相同的兩個細胞。

第14頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四如果我們利用某些理化因素，在細胞分裂中期阻止紡錘和中間隔膜（細胞板）的形成，而使已復制的染色體不能分向兩極，不能在中間形成隔膜，結果就形成了染色體組加倍的細胞。第15頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四如果這時理、化因素消失，那么這個細胞再分裂形成的細胞便有了加倍的染色體了。以這樣的細胞形成的組織、器官和由它產生的后代就是多倍體了。

第16頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四染色體的加倍也可以通過保留受精卵第二極體即抑制卵子的第二次成熟分裂或抑制受精卵的第一次卵裂來實現。第17頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四魚類受精細胞學研究表明：魚類精子入卵的時期是第二次減數分裂的中期，卵子受精后放出第二極體。如果設法抑制第二極體的放出即形成二倍體卵，二倍體的卵原核與正常精原核結合就形成三倍體；第18頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四如果卵子受精后:排出第二極體形成單倍體卵單倍的卵原核與單倍的精原核結合形成二倍的受精卵在這時再抑制受精卵的第一次卵裂，則產生四倍體。第19頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四三倍體育種的方法：在減數分裂過程中處理卵母細胞，阻止減數分裂過程中第一極體或第二極體放出，阻止卵細胞的染色體減半，從而產生2n的卵細胞。2n的卵細胞與正常減數分裂產生的精子(1n)結合，產生3n的受精卵，其結果可發育成三倍體個體。第20頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四三倍體育種的方法：在減數分裂過程中處理卵母細胞，阻止減數分裂過程中第一極體或第二極體放出，阻止卵細胞的染色體減半，從而產生2n的卵細胞。2n的卵細胞與正常減數分裂產生的精子(1n)結合，產生3n的受精卵，其結果可發育成三倍體個體。第21頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四四倍體育種的方法則是在合子進行第一次有絲分裂時實施刺激，阻止第一次有絲分裂，結果可形成四倍體第22頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四AA

A-AA-AA-AA-AAAAA第一次分裂第二次分裂卵母細胞的正常減數分裂示意圖A-A代表細胞復制后含有二條染色單體的一條染色體A代表細胞中的一條染色體；AA卵母細胞第23頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四AAA-AA-AA-AA-AAAAA阻止第一極體放出產生三倍體的示意圖a經過減數分裂后的精子AAA

三倍體AAA第24頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四AAA-AA-AA-AA-AAAAA阻止第二極體放出阻止第二極體放出產生三倍體的示意圖b經過減數分裂后的精子AAA

三倍體AAA第25頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四AAA-AA-AAAAA阻止第一次有絲分裂四倍體產生的示意圖AA受精卵第26頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2誘導多倍體魚類的方法

人工誘導魚類多倍體的方法主要有生物、物理和化學方法三種。

第27頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四

2.1生物學方法

遠緣雜交、核移植及細胞融合是采用生物方法誘導魚類多倍體的有效途徑。Marian等(1978)最早發現草魚♀×鳙♂之間的雜種是異源三倍體;第28頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四（同源多倍體：各染色體組的內容相同，來自同一物種（AA）（AAAA），同源多倍體與原來的二倍體具有相同的遺傳物質，只是在數量方面加倍罷了；

第29頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四異源四倍體是可育的，而不加倍的（AB）可能是雜種不育。異源四倍體或是同源四倍體，也具有可育性）。

（AA）（BB）（AABB）×（AAAA）×（BBBB）（AABB）異源多倍體：染色體組內容不相同，來自不同物種也稱雙二倍體。（AA）×（BB）（AB）+（AB）第30頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四魚類的遠緣雜交可能產生單倍體、二倍體和多倍體(Chevassus1983)。用雌性草魚(2n=48)與雄性三角魴(2n=48)雜交，獲得子一代染色體數目為72的草魴雜種三倍體(劉思陽1987)。第31頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四用異育銀鯽與興國紅鯉雜交獲得復合四倍體(種間雜交)，第二極體排放受到抑制從而產生多倍體，而種內雜交很少有不排出第二極體的,其機理尚需進一步探討；第32頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四核移植誘導魚類多倍體技術仍處于實驗階段，用四倍體的草魚培養細胞的細胞核作為供體移植到泥鰍的去核卵內，獲得心跳期的四倍體胚胎，該技術的成熟很可能成為誘導四倍體魚類的有效途徑之一第33頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四細胞融合主要誘導魚類囊胚細胞與囊胚細胞、囊胚細胞與未受精卵、囊胚細胞與受精卵或者受精卵與受精卵之間的細胞融合，第34頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四但由于細胞內染色體發生重排，實際得到是含各種不同數量染色體的魚類細胞群。但利用這一技術可以探索改良品種的可能性。第35頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四

2.2物理學方法

主要包括溫度休克法靜水壓法，高鹽高堿法電休克法。第36頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四物理學方法機制主要是通過破壞微管形成，使由微管蛋白聚合成的微管解體或阻止微管的聚合過程，使染色體失去移動的動力，人為抑制染色體向兩極移動，形成多倍體細胞。

第37頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2.2.1溫度休克法即用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導三倍體(抑制第二極體排放)或四倍體(抑制第一次卵裂)的方法。根據處理溫度的高低分為熱休克法和冷休克法。一般冷水性魚類如鮭科魚類，通常用熱休克，溫度范圍為28℃～36℃；第38頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四溫水性魚類可以用熱休克，也可用冷休克，溫度范圍為0℃~10℃左右。鯉魚用熱休克可以獲得較高比例的三倍體，香魚三倍體的誘導用冷、熱休克均可獲得令人滿意的結果。第39頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四進行溫度處理最重要的是必須確定處理的開始時間持續時間以及溫度高低魚類溫度休克敏感性的差異除了遺傳背景外，還與卵子成熟度有關。第40頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四美洲紅點鮭卵受精后15min用28℃高水溫熱休克處理10min，可誘導出100%的三倍體，孵化率42%。日本山口縣外海水產試驗場在水溫15℃條件處理牙鲆受精卵4min，誘導出100%的三倍體牙鲆。第41頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四實例：日本學者1943年將受精后10分鐘的鯉魚卵用0.5－3℃處理10－30分鐘可獲得三倍體；英國專家1972年對鰈魚與川鰈雜交的受精卵（受精后15分鐘）用0℃進行休克3.5小時，獲得100%的三倍體并養成了成魚。第42頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四美國Valenti(1975)對奧里亞羅非魚的受精卵進行冷休克處理，獲得三倍體魚。方法是將正在排卵的雌魚捕出進行人工擠卵，加入精液，受精后14分鐘后在11℃水溫下處理1小時，再轉入32℃條件下孵化成魚苗，多倍體獲得率為75%。第43頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四水生所將受精后3分鐘的鯉魚卵用0－1.5℃的水溫處理30分鐘獲得20－25%的三倍體。草魚與團頭魴雜種受精卵在有受精后5分鐘在0－2℃下進行冷處理20分鐘，獲得57%的三倍體，還有14%的四倍體。第44頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四如果從受精后44分鐘開始處理，持續時間26－34分鐘，四倍體獲得率為30－40%。草魚卵用相同的方法處理可獲得30%左右的三倍體。第45頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2.2.2靜水壓法(637-650kg/cm2)

抑制第二極體的排出或者抑制第一次卵裂。該方法最佳條件易于掌握，處理程序易于標準化，對受精卵的損傷小，處理3~5min,誘導率高(一般在90%～100%)。但需專門的設備如水壓機等，同時樣品室容量有限，不適宜大規模生產。第46頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四Streisinger等(1981)用靜水壓阻止第二極體排出，同時用乙醚阻止受精卵的第一次有絲分裂，從而產生純合二倍體雌核發育斑馬魚。桂建芳等(1990)采用靜水壓處理獲得了批量三倍體和少數四倍體彩鯽。第47頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四2.3化學方法所采用的化學藥品主要有秋水仙素細胞松馳素B(CB)聚乙二醇(PEG)6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)。

第48頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四這些化學藥物對染色體的運動并無影響，主要通過阻止分裂溝的形成抑制細胞質的分裂阻止極體的釋放而形成多倍體。第49頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四秋水仙素能阻止有絲分裂細胞中紡錘的形成，使已經縱裂了的染色體不能分向兩極，當藥物消失后，恢復常態，受精卵重新進行正常分裂，但此時細胞內染色體數目卻因此而增加了，從而形成一個染色體加倍的重組核。第50頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四用0.01%秋水仙素浸泡處于第一次卵裂前的溪紅點鮭Salvetinuspoutinatis受精卵產生了多倍體以及多倍體與二倍體的嵌合體。第51頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四水生生物所(1976)也曾用50－100ppm秋水仙素處理草魚♀×團頭舫♂雜種（2-4細胞期胚胎）受精卵20分鐘，獲得一定比例的三倍體和四倍體。第52頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四0.02%秋水仙素處理魚卵1小時可全部殺死鯉魚卵。用秋水仙素處理容易形成嵌合體且成活率較低，人們常用秋水仙堿與種間雜交相結合誘發異源多倍體。第53頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四細胞松馳素B是一種細菌的代謝產物，細胞松弛素B法(簡稱CB法)它能抑制肌動蛋白聚合成微絲，干擾細胞分裂從而產生多倍體。這一方法應用也較廣，但細胞松弛素B法易產生鑲嵌體和畸型胎。第54頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四用濃度10mg/L的細胞松馳素B(溶解于2.5%DMSO)處理大西洋鮭Salmosalar的受精卵獲得二倍體、三倍體和四倍體的嵌合體，但以三倍體為主。第55頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四Refstire(1981)用濃度為1μg/mLCB溶液(0.1%DMSO)處理虹鱒受精卵30～40h直至4胞期，也獲得了多倍體與三倍體的嵌合體，但以四倍體為主。盡管細胞松馳素B的誘導效果較好，但因是致癌劑，影響了它的使用推廣。第56頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四聚乙二醇是一種常見的細胞融合劑，Ueda等(1986)用聚乙二醇處理虹鱒的精子，然后讓其與卵子受精，三倍體虹鱒胚胎獲得率為40%。

第57頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)自1993年開始廣泛應用于誘導貝類多倍體，其低毒、高效、價格便宜，但目前還沒有用來誘導魚類多倍體的報道?；瘜W藥品一般較貴，而且有毒性，誘導的多倍體往往是嵌合體，不如溫度休克與靜水壓處理誘導魚類多倍體使用普遍。第58頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四3魚類多倍體的倍性鑒定

誘導形成的魚類多倍體需要進行染色體倍性的測定。測定的方法主要分為兩種：直接方法：染色體計數和DNA含量測定等。間接方法：細胞測量、蛋白質電泳、生化分析和形態學檢查等。

第59頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四多倍體魚具有體型較大的特點，如鱗片、體長、體高、魚鰭以及紅血球核特別大，從外形上也可辨別其可能是多倍體。檢查不育遠緣雜種的可育性，如果可育，說明染色體已加倍。第60頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四對于卵裂至囊胚晚期或至腸胚早期的受精卵用染色體制片直接計數測定；剛孵化出的仔魚則用紅血球核體積和核面積測量計算測定較為合適；第61頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四到魚苗乃至成魚如保留活體則可采用取血測量紅血球體積、測定DNA含量、蛋白質電泳法（血清蛋白的差異）

，或剪下鰭條進行蛋白質電泳、生化分析以及外部形態學觀察測定。當然也可取魚腎臟做染色體制片，進行染色體計數以及蛋白質電泳分析來測定。上述方法中染色體制片直接計數法是最直接和精確的鑒定方法。第62頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四4誘導魚類多倍體技術在水產養殖上的應用

4.1控制過度繁殖

湖泊等一些養殖水域，需要合理的放養種群及密度，以維持良好的生態環境。為了有效控制某一種群的過度增生，避免造成對環境的破壞，采用放養不育的三倍體魚類可解決這一問題。第63頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四如草魚雖可控制雜草的生長，但草魚的天然繁殖能力強，易造成對水生植物的毀壞，用人工誘導的方法產生具有消耗雜草能力的不育三倍體草魚乃是很有效的途徑之一。第64頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四

4.2提高生長速度

原理：利用三倍體魚的不育性，使原來用于性腺發育的能量被用作體細胞的生長，因而成體三倍體的生長速度普遍超過二倍體。三倍體泥鰍最初2個月生長速度和二倍體一樣，但4～5月齡后生長速度超過二倍體的20%～30%(Kim等，1994)；三倍體斑點叉尾在2月和4月齡時與二倍體生長速度差不多，13月齡后生長速度比二倍體快15%左右(Wolters等，1982)。具有極好的潛在經濟價值。

第65頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四4.3延長魚類壽命

一些魚類在繁殖期間會遭受損失甚至全部死亡，如大麻哈魚產卵后通常死亡，虹鱒在缺乏產卵支流的湖泊中會有很高的死亡率。三倍體魚類因性腺不能充分發育，避開繁殖期，從而避免了繁殖期死亡。此外，一些研究者認為，三倍體魚類的口感及出肉率較高，如虹鱒三倍體的口感明顯優于二倍體(張涌泉，1989)。

第66頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四5甲殼動物多倍體育種的進展情況近年來，已對五種十足類進行了多倍體育種研究。相建海等用CB和溫度休克兩種方法成功誘導了中國對蝦多倍體個體。與對照組相比，實驗蝦平均生長都較快。包振民等用細胞松弛素B法誘導出了中國對蝦三倍體。中華絨整蟹多倍體和日本沼蝦的多倍體研究亦有報導。第67頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四6處理方法與多倍體誘導率及成活率的關系細胞松弛素與物理因素(溫度和壓力)相比，有可能得到更高的三倍體誘導率、這是因為細胞松弛素抑制細胞膜微絲網狀系統的形成，細胞不能進行分裂，但不影響細胞內的核分裂。而溫度和壓力同時抑制微絲和微管，這既阻止染色體運動又阻止細胞分裂。但這只是基于理論上的分析，尚缺乏實驗證明。第68頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四一般認為不管哪一種方法、如果能摸清三要素的優化處理條件：處理起始時刻持續時間處理強度(濃度、溫度等)誘導率都會提高。第69頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四一般認為囊胚期胚胎的成活率與處理起始時刻的關系不甚明顯，但持續時間延長和溫度過高(熱休克)或過低(冷休克)或細胞松弛素濃度過高會導致成活率降低。通常認為，多倍體胚胎死亡的主要原因是由于離體培養時環境條件未能很好地滿足其發育需求所致；另有一些學者認為，多倍體胚胎死亡的主要原因可能與誘導因子對卵子造成損害有關。第70頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四在日本沼蝦多倍體育種研究中，采用直接處理自然交配的抱卵親蝦(受精卵由母體攜帶孵化條件下)：不同刺激強度和不同持續時間的多組實驗胚胎均大量死亡，而對照組則少有死亡。因此，可以認為誘導因子對卵子的損害很可能是胚胎死亡的主要原因，而胚胎發育過程中環境因子為次要原因。第71頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四7甲殼動物多倍體育種過程中所遇到的問題7.1處理起始時刻的確定這是多倍體育種的關鍵，因為不論是誘導三倍體還是四倍體，都必須在細胞分裂的某一時刻阻止細胞分裂或染色體的分離和分配。第72頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四進行三倍體誘導育種時，要掌握減數分裂第一、第二次分裂的確切時間，以便及時處理，同樣誘導四倍體應該掌握第一次卵裂的確切時間。但是，不同生物的卵母細胞進行減數分裂和第一次有絲分裂的時間和過程有明顯的差異，即使同種生物，在不同的生活環境下(如溫度、水質、營養狀況等的差異其減數分裂和第一次有絲分裂的時間也會不同。第73頁，共82頁，2023年，2月20日，星期四7.2有效誘導率的提高溫度休克法誘導多倍體時，要考慮處理的最佳溫度和持續時間。溫度過高(熱休克)或者過低(冷休克)，都會對受精卵造成傷害導致胚胎的死亡率提高，無法得到大量的多倍體個體。同樣，如果處理時間過長，也會導致上述結果。第74頁，共82頁，202