甘薯脫毒試管苗生產技術規程2010-04-27發布2010-07-27實施貴州省質量技術監督局發布I前言 I 12規范性引用文件 13術語和定義 14脫毒試管苗的生產 24.1培養材料選擇 24.2外植體選擇 24.3莖尖剝離 24.4莖尖組織培養 24.5試管苗獲得及增殖培養 24.6試管苗的病毒檢測 24.7脫毒試管苗的試種鑒定 25脫毒試管苗的擴繁 25.1試管苗的轉接 35.2脫毒試管苗增值培養條件 36擴繁苗的病毒檢測 3 36.2病毒檢測 37原原種的生產 3附錄A(資料性附錄)培養基配制方法 4A.1儀器和設備 4A.2試劑 4A.3培養基類型 4A.4培養及配制操作步驟 4本標準根據GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分標準的編寫與規則》給出的要求起草。1NY/T402-2000脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測技術規程24.3莖尖剝離4.3.1將表面沖洗干凈的外植體置于超凈工作臺上，先用70%的酒精表面消毒10s,再用2%的次氯酸鈉溶液消毒10min～15min后，無菌水沖洗3次-5次，置于無菌濾紙上吸去水分。4.3.2將消毒好的外植體置于超凈工作臺上的雙目解剖鏡下，用解剖針輕葉至露出莖尖生長點，在僅留兩個葉原基(大小約0.2mm～0.4mm)處用解剖刀小心地將其切下，莖尖向上、切面向下置于試管或三角瓶內的莖尖誘導培養基(配制方法見附錄A)中，封口、編號。將甘薯莖尖培養在溫度23℃~28℃,光照強度2000Lx～3000Lx,每日光照12h～16h,相對濕度70%~增殖培養基(配制方法見附錄A)內培養，培養條件是22℃~28℃,2000Lx～3000Lx,光照時間12h/d。按NY/T1200中的6.1.3執行，將部分檢測3在超凈工作臺上，將培養30d～40d已形成5～8片展開葉的甘薯脫毒試管苗進行切段，每段留1～2片葉，葉面朝上插在固體增殖培養基(配制方法見附錄A)上，置于培養室或培養箱內培養。培養室(培養箱)溫度為22℃~28℃,光照強度為2000Lx～3000Lx,每日光照12h～16h,相對濕度按NY/T402中的4.1.1,4.1.2執行。4(資料性附錄)培養基配制方法A.1儀器和設備A.1.1高壓滅菌鍋A.1.4雙目實體解剖鏡A.1.6酸度計或pH試紙A.1.7加熱器A.1.8不銹鋼鍋A.1.9量筒、移液管A.1.10燒杯、玻璃棒和滴管A.1.11試管、三角瓶、培養瓶、耐高溫封口材料或瓶蓋A.1.12手術剪、手術刀、解剖針、鑷子A.2.1莖尖組織培養所用試劑為分析純級別，培養基用水為蒸餾水；試管苗增殖階段所用試劑為分析或化學純級別，水為自來水。A.2.2MS培養基母液成分及含量(mg/L)a)大量元素：硝酸鉀(KNO3)1900,硝酸銨(NH4NO3)1650,硫酸鎂(MgSO4)370,磷酸二氫鉀c)鐵鹽：乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)37.3,硫酸亞鐵(FeSO4·7H20)27.8d)有機物：甘氨酸2.0,鹽酸硫胺素(VB1)0.4,鹽酸吡哆醇(VB6)0.5,煙酸0.5,肌醇100A.2.3酒精、次氯酸鈉(NaC1O)、鹽酸(HC1)、氫氧化鈉(NaOH)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸 A.2.4蔗糖、白糖、瓊脂A.3培養基類型A.4培養及配制操作步驟5A.4.2配制MS培養基母液使用的水質為蒸餾水、重蒸餾水或無離子水A.4.3大量元素母液配制：按100倍的用量分別稱取各大量元素，先單獨定溶配制成母液。每升培養基取各種母液10ml。A.4.4微量元素母液配制：按100倍的用量分別稱取各微量元素，單獨溶解，再混合、定溶。每升培養基取此母液10ml。A.4.5鐵鹽配制：按100倍用量分別稱取兩種試劑，單獨加熱煮沸、再混合，混合后的溶液繼續加熱使之充分螯合，冷卻后定溶備用。每升培養基用鐵鹽母液10ml。A.4.6有機物配制：以100倍用量分別稱量分別溶解，再混合、定溶。每升培養基取此母液10ml。A.4.7植物激素配制A.4.8萘乙酸NAA配制：按0.1mg/ml濃度適量稱取萘乙酸NAA,先用少許95%酒精使之溶解，再用蒸餾水定溶，置于4OC冰箱貯藏待用。A.4.9赤霉素GA3配制：按0.05mg/ml濃度適量稱取赤霉素GA3,先用少許95%酒精使之溶解，再用蒸餾水定溶，置于4OC冰箱貯藏待用。A.4.106-芐氨基腺嘌呤6-BA配制：按0.5mg/ml濃度適量稱取6-芐氨基腺嘌呤6-BA,用少許1NHC1使之溶解，再用蒸餾水定溶，置于4OC冰箱貯藏待用。a)溶化瓊脂：按需量稱取瓊脂入不銹鋼鍋內，加入所需配制培養基體積一半的水，加熱溶化瓊脂b)加母液：將稱量好的各種母液、糖加到溶解好的瓊脂液中，繼續加熱并攪拌，待糖溶解，加水至所需配制培養基體積，攪拌均勻。c)調pH值：用酸度計或精密pH試紙測量所配制培養基的pH值，加0.1NHC1或NaOH溶液調節培養基pH值在5.8-6.0之間