果蔬成分生化分析大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院xxxxxxxx摘要：果蔬中養(yǎng)分成分多種多樣，本試驗(yàn)以盤菜，蘿卜，豆芽梨子等為爭論對象，對其主要養(yǎng)分成分〔維生素C含量、總糖及復(fù)原糖含量、蛋白質(zhì)含量〕測定與其過氧化物酶分析果。總的來說，疆蘋果與蘋果養(yǎng)分價值都高，但疆蘋果相對于蘋果養(yǎng)分。關(guān)鍵詞：主要養(yǎng)分成分；過氧化物酶前言：〔多屬于草本植物〔多屬于草本植物。蔬菜是人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭恍猩俚氖澄镏弧Ｊ卟丝晒┙o人體所必需的多種維生素和礦物類蘿卜素、二丙烯化合物、甲基硫化合物等。目前果蔬中的養(yǎng)分素可以有效預(yù)防慢性、退質(zhì)。據(jù)1990年統(tǒng)計，人體必需的維生素C的90%、維生素A的60%來自蔬菜。此外，蔬菜中還有多種多樣的植物化學(xué)物質(zhì)類蘿卜素、二丙烯化合物、甲基硫化合物等。目前果蔬中的養(yǎng)分素可以有效預(yù)防慢性、退行性疾病的多種物質(zhì)正在被人們爭論覺察。蔬菜中含有多種養(yǎng)分成分，其主要要養(yǎng)分特點(diǎn)如下：1〕水分—穎蔬菜的含水量在90％以上，它是蔬菜鮮嫩程度的標(biāo)志。2〕維生素—綠色、橙色蔬菜中含有較多的蘿卜素、維生素c、核黃素及葉酸。3〕無機(jī)鹽—蔬菜是無機(jī)鹽的重要來源。綠色蔬菜含量最為豐富。4〕食物纖維—各種蔬菜都含有，它有促進(jìn)腸道蠕動、降低膽固醇和改善糖代謝等作用。蔬菜，其特點(diǎn)為：1〕各種鮮水果都含有維生素c2〕水果中的纖維素、果膠是自然的緩瀉劑。3〕水果具有芳香的果味，明媚的顏色能促進(jìn)食欲。4〕水果含有較多的鈉、鉀、鎂等元素，合成堿性食物。材料、試劑與器材材料各種水果和蔬菜試劑〔一〕果蔬中維生素C的測量測定1%草酸溶液、2C0.1%2，6—二氯酚靛酚溶液〔二〕果蔬中總糖及復(fù)原糖含量測定蒽酮試劑、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液、LlH溶液〔三〕果蔬中蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液、考馬斯亮蘭G—250染料試劑、0.05mol/LTris—Hcl緩沖液〔PH6.8〕(四)①聚丙烯酰胺凝膠電泳分別過氧化物酶同工酶試驗(yàn)A〔分別膠緩沖液、B〔濃縮膠緩沖液、C〔分別膠貯液、D〔濃縮膠貯液、E核黃素、FTEMED、0.14%過硫酸銨、電極緩沖液、封板膠、上樣緩沖液、染色液②過氧化物酶活性的測定100mmol/L磷酸緩沖液PH6.0反響混合液：100mmol/L磷酸緩沖液〔PH6.0〕50ml于燒杯中，參與愈創(chuàng)木酚28μl，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，參與30%過氧化氫19μl，混合均勻，保存于冰箱中。器材臺秤；可見光分光光度計；恒溫水浴鍋；高速離心機(jī)；漩渦混合器；垂直板電泳槽及附件(玻璃板、硅膠條、梳子、導(dǎo)線等)；穩(wěn)壓穩(wěn)流直流電泳儀；微量注射器。各種玻璃器皿試驗(yàn)方法試驗(yàn)設(shè)計試驗(yàn)一 果蔬中維生素C的定量測定Ⅰ步驟1、制備穎果蔬液：洗凈穎果蔬，擦干外表水分，剝?nèi)ネ馄ぃQ取1g試驗(yàn)材料放入研缽中，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，并用約30ml2-3次，洗出液也轉(zhuǎn)入錐形瓶中，于5030min，取出，冷卻e+復(fù)原染料，在冰箱中保藏。稱取試驗(yàn)材料1g放入研缽中，加水3ml，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，12ml2-36mol/l10ml30min，冷去后用20%NaoHPH100ml，冰箱保存。Ⅱ試驗(yàn)結(jié)果維生素c標(biāo)準(zhǔn)液0.41ml樣品液0.43ml0.46ml盤菜樣品液0.58ml0.56ml結(jié)果計算：v=(0.43+0.46)/2=0.445M1=0.445×10/41=89/820M2=89/820×4×5=2.17所以白蘿卜每100克樣品中含維生素2.17g同理得：每100克的盤菜樣品中含維生素c2.80g試驗(yàn)結(jié)論：盤菜的維生素含量比白蘿卜高。試驗(yàn)二 果蔬中總糖及復(fù)原糖含量的測定Ⅰ步驟1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：61步管號表步管號驟 0 1 2 3 4 5標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液/mL00.10.20.30.40.5蒸餾水蒸餾水1.00.90.80.70.60.5置冰水浴中5min蒽酮試劑蒽酮試劑4.04.04.04.04.04.0煮沸1010′，在620nm處比色AA620nm〔mg/mL〕為橫坐標(biāo)做圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品中復(fù)原糖的提取和測定保存。并用約30mL蒸餾水沖洗研缽2～350℃水〔使復(fù)原糖浸出。過濾后冰箱保存。不同果蔬需進(jìn)展不同程度稀釋。水果如柚子等：取濾液1mL→100mL；蔬10mL→100mL。1mL4mL沸水浴中煮沸10min，取出冷卻后比色，其他條件與做標(biāo)準(zhǔn)曲線一樣。測得的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查算出樣品液的糖含量。3、樣品中總糖的提取、水解和測定箱保存。用約12mL蒸餾水沖洗研缽2～3中參與6mol/L鹽酸10mL，攪拌均勻后在沸水浴中水解0.5h，冷卻后用20%NaOH溶液中和至pH100mL，過濾后冰箱保存。5mL→100mL；蔬10mL→100mL。1mL六、計算依據(jù)以下公式分別計算試驗(yàn)材料中復(fù)原糖和總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)〔。W〔復(fù)原糖〕＝

C1V1m

×100%W〔總糖〕＝

C2V2m

×0.9①×100%式中：

〔復(fù)原糖：復(fù)原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)〔總糖：總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)〔%〕C1：復(fù)原糖的質(zhì)量濃度〔mg/mL〕C2：水解后復(fù)原糖的質(zhì)量濃度〔mg/mL〕V1：樣品中復(fù)原糖提取液的體積〔mL〕V2：樣品中總糖提取液的體積〔mL〕m：樣品質(zhì)量①乘0.9是為了從測定出的總糖水解成的單糖中扣除水解時所消耗的水量。試驗(yàn)結(jié)果：g/LAbs0.010.0540.020.1120.030.1580.040.2120.050.050.257蘿卜復(fù)原總糖0.464蘿卜總糖0.881盤菜總糖0.388盤菜復(fù)原總糖0.3499.03%蘿卜總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：17.14%6.79%盤菜總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：7.549%試驗(yàn)三 果蔬中蛋白質(zhì)含量測定Ⅰ步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制7試劑0123456牛血清白蛋白0.0mL0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水1.0mL0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL甲試劑5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃〔或室溫下〕放置10min乙試劑乙試劑0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0～5〔或室溫下n下，以“0”號管調(diào)零，測定各管吸光度。以各管吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品制備1g1mLH2O0.05mol/LTris－HCl緩沖液〔pH6.8〕研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL水或緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管〔注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL，Lm5n供分析用。3、樣品測定2試劑空白管測定管蛋白質(zhì)提取液-1.0mL蒸餾水1.0mL-甲試劑5.0mL5.0mL混勻，于20～25℃〔或室溫下〕放置10min乙試劑乙試劑0.5mL0.5mL0～5〔或室溫下n下，以“0”號管調(diào)零，測定各管吸光度。Ⅱ試驗(yàn)數(shù)據(jù)盤菜盤菜0.921蘿卜0.436牛血清蛋白溶液牛血清蛋白溶液ug/LAbs00200.104400.215600.314800.4681000.507M〔盤菜〕=1737.74gM(蘿卜)=822.64g試驗(yàn)四Ⅰ步驟貯液配制按上表配制貯液，但應(yīng)留意1～2過硫酸銨應(yīng)當(dāng)天配制。電泳槽的安裝做成的模套而構(gòu)成，由硅酮橡膠套打算兩玻璃板之間距離約為1.5mm，形成一在一起后，凝膠槽子兩側(cè)形成前后兩個槽，供裝電極緩沖液和冷凝管用。〕，然后正確放入硅膠條中，夾在電泳槽1%瓊脂溶液〔1g瓊脂加電極緩沖液〔注：已稀釋10倍〕至100mL，煮沸→60～70℃時用〕封底，待瓊脂凝固后即可灌制凝膠。制膠將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液。〔1〕配制分別膠A 3mLC 6mL0.14%過硫酸銨 水 3mLTEMED 15μL將分別膠沿長玻璃板參與膠室，留神不要產(chǎn)生氣泡，加至距短玻璃板頂端3cm處，馬上留神地掩蓋2～3mm〔約40min〕，當(dāng)膠與水層的界面重消滅時說明膠已聚合。〔2〕配制濃縮膠B 1.5mL3mL1.5mL6mLTEMED 18μL注：TEMED濃縮膠，插入梳子〔即樣品槽模板〕，待膠凝后，留神取出梳子。將稀釋10〔短板側(cè)〕緩沖液要求沒過樣品槽，下槽〔長板側(cè)〕緩沖液要求沒過電極，備用。〔過氧化物酶的提取〕按以下比例稱取果蔬：梨：1:2蘿卜與盤菜：1:10〔W:Vg:mL〕14000r/min15min，取上清液貯存于低溫冰箱備用。點(diǎn)樣〔50μL〕吸取適量樣液，在濃縮膠上層點(diǎn)樣。點(diǎn)樣量：柚子、梨：20、40、50μL蘿卜、盤菜：10、20、30μL點(diǎn)樣時須留神，防止樣品液集中。0.1%2～36．電泳接好電源線〔上槽即加樣槽為負(fù)極〕。翻開電源開關(guān)，調(diào)整電流到10mA1cm3h。剝膠開玻璃，去掉濃縮膠〔留意先進(jìn)展測量〕，將分別膠放入培育皿。染色、記錄結(jié)果1～10min褐色。用去離子水漂洗，并拍照、記錄酶帶距離。實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 ：②過氧化物酶活性的測定Ⅰ步驟2.5mL50mL〔此處僅稀釋蘿卜與盤菜，水果均不稀釋。313mL1mL，作為比照，另2只中分別參與反響混合液3mL和上述酶液各1mL〔如酶活A(yù)bs Abs 變化 0→11→22→33→44→5470nm1min〔5min，取其平均值。Ⅱ數(shù)據(jù)處理470nm線斜率k，此斜率為每分鐘吸光度變化價值。1A470變化0.01為一個過氧化物酶活性單位〔u〕表示。2、每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即過氧化物酶活性<u/〔g·min〕>=k/〔0.01×W×t〕式中： k為上圖圖線的斜率Wgt 為反響時間，min試驗(yàn)數(shù)據(jù)：時間min012345盤菜0.1460.6810.9581.1.2441.292蘿卜0.0390、1870.2730.3510.4240.475值min盤菜0.5350.2270.1810.1050.蘿卜0.1480.0860.0780.0.試驗(yàn)方法概述〔一、試驗(yàn)一：2，6-二氯酚靛酚滴定法氧化型染料在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色，在酸性溶液中呈紅色。成為復(fù)原型后為無色。用氧化型染料來滴定復(fù)原型維生素C，當(dāng)?shù)沃寥繌?fù)原型維生素C被氧化后，在稍滴一點(diǎn)呈微紅色為終點(diǎn)。滴定用去染料量與樣品中復(fù)原型維生素C(二)、試驗(yàn)二：為蒽酮比色法原理單糖類遇到濃硫酸時,脫水生成糠醛衍生物,后者可與蒽酮縮合成藍(lán)綠色的化合物,20-200mg(三)、試驗(yàn)三：考馬斯亮蘭法考馬斯亮藍(lán)G-250G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸取在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸取在595nm595nm處的光吸取與595nm〔四、試驗(yàn)四：①聚丙烯酰胺凝膠電泳法凝膠電泳具有一般電泳的電場效應(yīng)，即在確定pH的溶液中，樣品分子由于解離或吸附，移動較快，而體積大，外形不規(guī)章的樣品分子受阻力大，移動較慢。因此，凝膠電泳不但區(qū)分力。②比色法在有過氧化氫存在下，過氧化氫酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470nm處有最大吸取，可用分光光度計測量470nm的吸光度變化測定過氧化氫酶活性。試驗(yàn)分析與爭論試驗(yàn)一：溶解，以及總糖的最終PH不為7都會給本試驗(yàn)的結(jié)果帶來誤差，而且樣品1g很難把握的比照組，并且不能為蒸餾水，儀器也需要?dú)w位。試驗(yàn)二：假設(shè)測試要求很嚴(yán)格，可以在試劑中參與后5～20min測定吸光度，由于在這段時間顏色是最穩(wěn)定的，比色反響需在1h不行用手摸比色皿，可用塑料或玻璃比色皿，測定完后用95%乙醇將