目前一頁\總數一百二十頁\編于十點【學習要求】1.掌握基于靶點結構的藥物設計、全新藥物設計、計算機虛擬篩選、基于片段藥物設計的基本概念。2.熟悉蛋白質三維結構預測法、分子對接方法及分類、基于片段藥物設計的基本思路、基于片段藥物設計的優點；片段篩選的主要檢測技術；片段優化的常用方法。3.了解全新藥物設計的常用方法、磁共振檢測技術的分類和原理；SAR-by-NMR的原理和應用；Tether和二次Tether技術的原理；結晶篩選的研究流程。目前二頁\總數一百二十頁\編于十點基于靶點結構的藥物設計是指一般應用由X射線衍射、磁共振或分子模擬（同源建模法等）提供的蛋白質結構信息，來輔助設計具有生物活性的化合物的過程。基于配體結構的藥物設計是從研究一系列藥物分子對同一受體的活性出發，比較它們的結構變化與生物活性之間的關系，找到對該受體能發生結合并產生活性的最普遍的結構因素，并根據此結構特征設計新的藥物分子。目前三頁\總數一百二十頁\編于十點以靶點結構為主的藥物設計可分為三大類全新藥物設計：根據靶點活性位點構建配體分子對接：以靶點結構來搜尋配體基于片段的藥物設計：根據靶點活性位置來構建配體片段目前四頁\總數一百二十頁\編于十點基于生物大分子靶點結構的藥物設計方法目前五頁\總數一百二十頁\編于十點第一節

靶蛋白結構的預測目前六頁\總數一百二十頁\編于十點蛋白質結構與功能研究已成為后基因組時代最具挑戰性的研究課題。當前測定蛋白質結構的主要方法仍然是X-射線晶體學方法和多維核磁共振技術。蛋白質結構的測定速度卻遠遠落后于基因組測序和氨基酸序列的測定速度，無法滿足蛋白組學及其相關的學科需要。目前七頁\總數一百二十頁\編于十點（1）目標序列與模板序列的比對；（2）根據同源蛋白的多重序列比對結果，確定同源蛋白的結構保守區以及相應的框架結構；（3）目標蛋白質結構保守區的主鏈建模；（4）目標蛋白質結構變異區的主鏈建模；（5）側鏈的安裝和優化；（6）對模建結構進行優化和評估。同源模建的主要步驟目前八頁\總數一百二十頁\編于十點序列比對序列比對是同源模建的關鍵，大多數的序列比對方法都是以目標蛋白質和模板蛋白質序列之間的相似性為基礎的，其準確性可以通過進行多序列比對得到提高。目前常用的序列比對程序有FASTA和BLAST等。許多藥物設計軟件公司也開發了同源模建法預測蛋白的軟件模塊，如Tripos公司的Composer、Accelyrs公司的Homology等。目前九頁\總數一百二十頁\編于十點目前十頁\總數一百二十頁\編于十點折疊識別（foldrecognition）當目標蛋白質找不到已知結構的蛋白質作模板時，可以采用蛋白質折疊識別方法進行三維結構預測。折疊識別法就是總結出已知的蛋白質結構模式作為目標蛋白質進行匹配的模式，然后經過現有的數據庫的觀察，總結出可以區分正誤結構的平均勢函數作為判別標準，來選擇最佳的匹配方式。目前十一頁\總數一百二十頁\編于十點從頭預測（denovoprediction）蛋白質結構從頭預測是一個尚未成熟的研究領域，但發展潛力十分巨大。因為該方法不需要知道任何一個目標序列的同源蛋白質，僅從蛋白質的一級結構預測其高級結構，一旦從頭預測的方法獲得重大突破，將有助于人們理解蛋白質折疊的過程，影響蛋白質結構穩定性的因素等基本問題。目前十二頁\總數一百二十頁\編于十點活性位點的分析方法通過探針來探測簡單的分子或碎片如何能夠與生物大分子的活性位點很好地結合。用于分析的探針可以是一些簡單的分子或碎片，例如水或苯環作為探針，通過分析它們與活性位點的相互作用情況，可以找到這些分子或碎片在活性部位中的可能結合位置。目前十三頁\總數一百二十頁\編于十點活性位點分析法通常不能直接產生完整的配體分子，但它得到的有關靶點結合的信息對后面的全新藥物設計和分子對接等都有很好的指導意義。代表性的活性位點分析方法的軟件有GRID、MCSS和HINT等相關程序。目前十四頁\總數一百二十頁\編于十點GRIDGRID程序由Goodford研究小組開發，其基本原理是將靶點蛋白的活性部位劃分為有規則的網格，應用分子力場的方法計算探針分子（水分子或甲基等）在不同的格點上與受體活性部位的相互作用能，以此解析探針分子與靶點活性部位的相互作用情況，發現最佳作用位點。應用GRID程序研究流感病毒的重要靶點神經氨酸酶時，以氨為探針分子搜尋神經氨酸酶結合位點時發現用胍基取代抑制劑Neu5Ac2en的4-羥基，得到的化合物扎那米韋（zanamivir）活性大為提高，現已作為抗A型感冒病毒藥物上市。目前十五頁\總數一百二十頁\編于十點MCSSMCSS是Karplus課題組發展的一種活性位點分析方法，其基本思路與GRID方法相似，但處理方式更為細致、深入。例如GRID方法中僅考慮探針和蛋白質的非鍵相互作用，而MCSS法進一步包括了探子分子片段的構象能；GRID計算采用系統搜索法將探針分子片段依次放在每個格點上，而MCSS法將探針分子以多拷貝形式放置在活性口袋中，利用蒙特卡羅模擬結合分子力學進行優化來尋找最佳作用位點。目前十六頁\總數一百二十頁\編于十點Adlington等應用MCSS對前列腺特異性免疫抗原（PSA）的活性位點進行了詳細分析，以此對已有的PSA抑制劑進行結構優化，從而得到了迄今為止活性最高的PSA抑制劑，其IC50為（226±10）nmol/L。目前十七頁\總數一百二十頁\編于十點HINTHINT（hydrophobicinteraction）是Kellogg等研究的計算分子脂水分配系數及評價的程序，目前已商業化并已有SYBYL和InsightⅡ下的版本。在SYBYL最新版本中，HINT已作為一個正式模塊推出，并能夠進一步計算和顯示疏水場及兩分子間的疏水相互作用，并為CoMFA計算提供疏水場值。目前十八頁\總數一百二十頁\編于十點第二節

分子對接與虛擬篩選目前十九頁\總數一百二十頁\編于十點分子對接（moleculardocking）是通過研究小分子配體與靶點生物大分子相互作用，預測其結合模式和親和力，進而實現基于結構的藥物設計的一種重要方法。根據配體與靶點作用的“鎖鑰原理”，分子對接可以有效地確定與靶受體活性部位空間和電性特征互補匹配的小分子化合物。一、分子對接目前二十頁\總數一百二十頁\編于十點分子對接方法的分類根據對接過程中是否考慮研究體系的構象變化，可將分子對接方法分為以下三類：剛性對接、半柔性對接和柔性對接。①剛性對接是指研究體系的構象在對接過程中不發生變化；②半柔性對接是指在對接過程中研究體系中的配體構象允許在一定范圍內變化；③柔性對接是指研究體系在對接過程中構象可以自由變化。目前二十一頁\總數一百二十頁\編于十點根據對接時配體分子的形式還可以將分子對接方法分為兩種基本類型，即整體分子對接法和片段對接法。整體分子對接法是運用特定搜索算法考察配體分子在靶點結合部位，根據評分函數找出最優結合方式。片段對接法是將配體分子視為若干片段結構的集合，先將其中一個或幾個基本片段放入結合空腔，然后在活性部位構建分子的其余部分，最終得到理論上最優的結合方式。目前二十二頁\總數一百二十頁\編于十點1.DOCK（1）應用程序產生一個填充靶點分子表面的口袋或凹槽的球集,整理成假定結合位點。（2）在假定結合位點上，應用一組球集表示配體，按照匹配原則確定配體與靶點的作用位點。（3）評價打分，DOCK支持多種評分函數，可以評價靶點活性部位與配體幾何形狀互補性、范德華作用和靜電作用等。有代表性的分子對接軟件目前二十三頁\總數一百二十頁\編于十點2.FlexX第一步是選擇配體的一個連接基團，稱為核心基團；第二步是將核心基團放置于活性部位，此時不考慮配體的其他部分；最后一步稱為構造，通過在已放置好的核心基團上逐步增加其他基團，構造出完整的配體分子。目前二十四頁\總數一百二十頁\編于十點3.Affinity第一步是應用蒙特卡羅或模擬退火法計算確定配體分子在靶點活性口袋的可能結合位置；第二步是通過分子力學或分子動力學方法進行細致對接。目前二十五頁\總數一百二十頁\編于十點DOCK分子對接步驟對配體和靶點結構分別加氫原子、力場參數和電荷計算蛋白溶劑表面目前二十六頁\總數一百二十頁\編于十點結合部位模擬計算結合部分能量網格目前二十七頁\總數一百二十頁\編于十點打分評價尋找最佳匹配位置目前二十八頁\總數一百二十頁\編于十點分子對接應用舉例通過對HIV-1蛋白酶與天門冬氨酸蛋白酶的結構進行比較，并借助X-衍射波譜的結果，人們獲得了高精確度（1.8nm）的HIV-1蛋白酶的三維結構，并建立起該酶的結構模型。隨后，Desjarlais等人根據其晶體結構中的酶活性部位，利用DOCK程序將劍橋晶體數據庫中的10000個分子與之進行分子對接，按照打分數值的高低排列。目前二十九頁\總數一百二十頁\編于十點然后對打分值最高的200個化合物進行嚴格篩選，評價這些分子能否與酶的Asp25發生相互作用。最后發現溴哌醇具有較好的結合作用，經生物學實驗測試表明，其Ki值為100mol/L，且選擇性很高。溴哌醇目前三十頁\總數一百二十頁\編于十點高通量篩選的缺陷傳統的高通量篩選遇到許多問題，一方面是藥理測試假陽性結果，另一方面是化合物樣品來源短缺。盡管已報道的化合物數量非常龐大，但實際制藥公司和有關研究機構現有的樣品庫卻數量有限，這種情況在我國表現更為突出。目前三十一頁\總數一百二十頁\編于十點二、計算機虛擬篩選技術利用現代計算機虛擬篩選技術可以有效克服上述困難，它利用計算機強大的運算能力，根據某個靶標的相關信息，利用三維藥效團搜索或分子對接的方法，對商業化的化合物樣品庫進行虛擬篩選以尋找可能的活性化合物，發現潛在的活性分子后，可以向公司或有關機構定購，然后進行藥理測試。與傳統的高通量篩選技術相比，虛擬篩選不存在樣品的限制，其成本也遠低于高通量篩選。目前三十二頁\總數一百二十頁\編于十點小分子三維數據庫

劍橋結構數據庫（Cambridgestructuraldatabase，CSD）是由劍橋大學的劍橋晶體數據中心（Cambridgecrystallographicdatacentre）提供的有關有機小分子晶體結構信息的三維結構數據庫系統。在CSD中，所有這些晶體結構都是通過X-射線或中子散射實驗技術獲得。目前，CSD包含超過25700個有機化合物、金屬有機化合物以及金屬配合物的晶體結構信息，其中約有89%的分子有明確的三維結構數據。劍橋結構數據庫目前三十三頁\總數一百二十頁\編于十點國家癌癥研究所數據庫到2000年為止，國家癌癥研究所數據庫（nationalcancerinstitutedatabase，NCI數據庫）共收集了約500000個化合物。盡管很多學術機構、政府部門及一些非營利組織提交測試的化合物沒有任何限制條件，但是企業研究所通常要求對它們提供的化合物結構和測試結果遵守保密協議。NCI數據庫中近一半的保密化合物公眾無法獲得。NCI數據庫最大的特點是擁有與之相配套的對公眾開放的實物庫。一般情況下，在NCI數據庫中始終有約60%的化合物實物儲備。目前三十四頁\總數一百二十頁\編于十點ACD-3D數據庫ACD-3D數據庫是MDL數據庫的一種，是用戶檢索化學品供應商和價格信息的一種有效途徑。目前，ACD-3D包含從世界范圍內的651種化學品目錄中收錄的將近40萬個化合物的信息，其中約33萬個具有三維結構，是目前世界上最大的可獲取的商業化學品結構數據庫。數據庫每半年更新一次。數據庫中的信息包含化學品的純度、類型、等級、劑量和可比價格等。目前三十五頁\總數一百二十頁\編于十點2003年MDL公司為了迎合高通量篩選而開發了數據庫availablechemicalsdirectory3D-screening（ACD-SC）。該庫的數據主要來自于42個商業化學品供應商的產品目錄。這一數據庫提供了化學品供應商所能夠提供的超過200萬個化合物的三維結構及相關信息。ACD-SC可以說是ACD-3D的擴展，而且所有的化合物都可以找到相關購買信息。目前三十六頁\總數一百二十頁\編于十點MDLdrugdatareport3D（MDDR-3D）MDDR數據庫是MDL數據庫產品中的一種。它的數據來源包括1988年以來11個國際專利部門的資料以及1500種期刊和300種會議論文中出現的約100000種與生物研究相關的化合物及其衍生物。該數據庫每月更新一次，每年化合物增長規模在10000種左右。數據庫中收錄信息的特點是包括生物活性和藥理性質方面的數據。目前三十七頁\總數一百二十頁\編于十點虛擬篩選的策略基于分子對接的虛擬篩選流程圖目前三十八頁\總數一百二十頁\編于十點小分子數據庫準備蛋白質結構準備二維分子數據庫蛋白質結構原子／鍵類歸屬三維結構轉化結構優化原子化／電荷歸屬結構轉化構象產生數據歸屬結合位點確定網格構造分子對接打分評價／選分子類藥性判斷侯選分子虛擬篩選后續分析目前三十九頁\總數一百二十頁\編于十點高通量篩選和虛擬篩選方法的比較方法測試化合物數量IC50<100mol/L命中數量IC50<10mol/L命中數量命中率（%）高通量篩選40000008560.021基于分子對接的虛擬篩選3651272134.8Doman等以2型糖尿病的靶點——蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）抑制劑的發現為例，比較了高通量篩選和虛擬篩選方法。經過虛擬篩選后再進行生物學測試，其“命中率”比隨機的高通量篩選提高了1700倍。目前四十頁\總數一百二十頁\編于十點舉例：雌激素受體調節劑英國Protherics分子設計公司發展了虛擬篩選方法DockCrunch，以雌激素受體三維結構為靶標，篩選了含有100多萬個化合物的MDL/ACD-SC數據庫。根據虛擬篩選結果，購買了37個化合物。藥理測試顯示，結合常數Ki小于100nmol/L的化合物有14個，有兩個化合物活性在nmol/L級別。目前四十一頁\總數一百二十頁\編于十點這些研究結果表明，與隨機篩選相比，虛擬篩選可以成百上千倍地提高篩選效率。因此，用虛擬篩選方法進行創新藥物研究無論是在提高新藥研究與開發的效率，還是在獲得新結構活性化合物的速度方面，均具有十分重要的意義。目前四十二頁\總數一百二十頁\編于十點三、反向分子對接2001年反向分子對接（inversedocking）概念的提出，無疑為藥物靶點發現掀起了一場新的革命。繼INVDOCK軟件后，TarFis-Dock、PharmMapper等免費在線服務器為人們所熟知并逐漸得到認可。其方便快捷的預測功能為藥物靶點的發現提供了至關重要的作用，是藥物研究與開發中不可或缺的重要工具。目前四十三頁\總數一百二十頁\編于十點反向分子對接是將一個生物學活性已知的化合物與給定蛋白質數據庫中的所有結合位點的三維結構進行對接，對于能夠實現對接的蛋白質，再進一步通過實驗方法來驗證其作為該活性已知化合物作用靶點的可能性。該技術能夠高效、大規模進行靶點的確定和驗證，預測與毒性相關的靶點。目前四十四頁\總數一百二十頁\編于十點根據配體-靶點之間的匹配程度，反向分子對接可分為藥效團模型法（pharmacophore）、配體相似法（ligandsimilarity）和結合位點相似法（sitesimilarity）等。目前四十五頁\總數一百二十頁\編于十點反向分子對接流程示意圖

目前四十六頁\總數一百二十頁\編于十點第三節

全新藥物設計目前四十七頁\總數一百二十頁\編于十點全新藥物設計也稱為從頭設計，它是根據靶點活性部位的形狀和性質要求，通過計算機自動構建出結構與化學性質互補的新配體分子。利用全新藥物設計的方法通常能夠在分子設計中引入一些新的化學結構，從而幫助研究者突破原有的思想束縛，提出全新的先導結構；但一般所設計的化合物通常需要研究者通過化學合成得到，因此設計人員一般也應具有很好的有機化學和藥物合成背景。目前四十八頁\總數一百二十頁\編于十點全新藥物設計的分類根據基本構建模塊的產生方法不同，全新藥物設計方法又進一步可細分為模板定位法、原子生長法、分子碎片法等，其中分子碎片法目前應用最為廣泛。目前四十九頁\總數一百二十頁\編于十點模板定位法模版定位法是指在靶點活性部位用模板構建出一個形狀互補的圖形骨架，然后再根據其他性質如靜電、疏水和氫鍵性質，把圖形骨架轉化為一個個具體分子。目前五十頁\總數一百二十頁\編于十點模板定位法設計配體示意圖目前五十一頁\總數一百二十頁\編于十點原子生長法原子生長法是指在靶點活性部位根據靜電、疏水和氫鍵相互作用，逐個添加原子，最終生長出與靶點活性部位性質、形狀互補的分子。原子生長法已發展成兩種類型，第一種是從種子原子開始生長原子，該種子原子為靶點活性部位易形成氫鍵的原子，一般以氧、氮等作用起始原子起點；第二種類型是從起始結構開始生長原子，該起始結構可以是已知的底物或底物的一部分，它預先對接在靶點活性部位上。目前五十二頁\總數一百二十頁\編于十點目前五十三頁\總數一百二十頁\編于十點分子碎片法分子碎片法是指在靶點分子的活性部位，根據靜電、疏水和氫鍵相互作用，以碎片為模板，逐步生長出性質與形狀互補的分子。這里指的碎片，是由單一官能團，如羥基、羰基或苯環所構成。分子碎片法又分為碎片連接法與碎片生長法兩種。目前五十四頁\總數一百二十頁\編于十點目前五十五頁\總數一百二十頁\編于十點分子碎片法進行藥物設計的幾種連接方式：目前五十六頁\總數一百二十頁\編于十點應用舉例：FKBP-12配體的發現目前五十七頁\總數一百二十頁\編于十點AgourooPharrnaoeutioals公司利用LUDI進行了FKBP-12配體的設計工作，以FKBP-FKSO6復合物的晶體結構作為起點，把FKS06從復合物中刪除，采用LUDI程序來尋找和FRBP的活性位點能形成匹配的分子片段。從LUDI計算所給出的多種可能的分子片段中發現a能夠很好地填充部分活性口袋，并和受體形成好的幾何匹配和能量匹配。進一步的研究表明，配體分子的亞甲基上引入酮基（化合物b）后能與Ile56的氨基形成氫鍵。目前五十八頁\總數一百二十頁\編于十點在此基礎上，再一次利用LUDI對配體分子進行生長。發現通過一個橋原子在化合物b的側鏈上連接芳香環有利于提高活性。經反復比較，LUDI的計算結果顯示在芳香環的間位連上一個酚羥基能夠和靶點Asp37形成靜電相互作用，有利于提高活性。研究人員合成了化合物c。生物活性測試結果表明，該化合物具有較好的活性，Ki＝16mol/L；而芳香環間位沒有酚羥基取代的化合物d的Ki值僅為116mol/L。目前五十九頁\總數一百二十頁\編于十點

第四節

基于片段的藥物分子設計目前六十頁\總數一百二十頁\編于十點一、基于片段的分子設計原理與方法基于片段的藥物設計（fragment-baseddrugdesign，FBDD）是一種將隨機篩選和基于結構的藥物設計有機結合的藥物發現新方法。基于片段的藥物設計方法首先篩選得到低分子量和低親和力的片段，然后基于藥靶結構信息將片段進行優化或連接，得到與藥靶親和力高并且類藥性強的新分子。目前六十一頁\總數一百二十頁\編于十點基于片段的藥物設計是為了克服傳統高通量篩選的缺陷而逐步發展起來的藥物發現新方法。缺點：高通量篩選盲目性大，命中率很低，對于部分藥物靶點很難篩選得到理想的化合物，而且命中化合物的類藥性比較差。高通量得到的活性化合物的各個片段往往不能與靶蛋白的活性口袋很好地結合，而且對其中的單個片段的優化往往會影響整個分子，甚至是與靶點結合位置的改變。目前六十二頁\總數一百二十頁\編于十點高通量篩選和基于片段藥物設計比較目前六十三頁\總數一百二十頁\編于十點一般來說，基于片段分子的設計研究可以分成三個階段：片段篩選、片段與藥靶復合物的結構確證和基于片段構建新分子。1.片段庫的建立

一個高質量的片段庫是進行基于片段藥物設計的前提條件。構建片段庫需要考慮三個因素：庫容量、化學結構多樣性和類藥性。目前六十四頁\總數一百二十頁\編于十點2.結構信息的確定

確定片段與藥靶結合的結構信息對指導片段轉化為先導化合物過程起到至關重要的作用。3.基于片段構建新分子

基于片段分子設計的最終目標就是要發現高活性的先導化合物甚至是候選藥物，這就需要利用藥靶活性位點與片段相互作用的結構信息，在片段基礎上進一步設計新的分子，以提高生物活性。目前六十五頁\總數一百二十頁\編于十點二、活性片段的檢測技術（一）磁共振技術利用NMR進行藥物篩選的基本原理在于配體與生物大分子結合后，許多NMR參數（如化學位移等）會發生改變，通過檢測并分析這些數據，可以來判定配體是否與靶點結合、結合的強弱以及結合的模式。NMR篩選片段的方法一般可分為兩種：檢測配體的篩選（liganddetectionbasedscreening，LDBS）和檢測靶點的篩選（targetdetectionbasedscreening，TDBS）。目前六十六頁\總數一百二十頁\編于十點1.檢測配體的篩選LDBS法的原理是化合物在強磁場輻射下，核躍遷為激發態，然后緩慢回復到基態并釋放出相應的能量，不同的核恢復到基態的時間不同，這個時間叫弛豫時間（relaxationtime）。弛豫時間的長短與分子大小成反比，小分子的化合物弛豫時間長，大分子的靶蛋白弛豫時間短，當藥物與靶蛋白結合后就變成大分子，弛豫時間就會變短。目前六十七頁\總數一百二十頁\編于十點用LDBS法進行化合物活性篩選時，首先用普通條件測定小分子化合物的NMR譜，然后向小分子化合物中加入靶蛋白，向磁共振儀引入一個適當的延時使靶蛋白分子不能被檢測到，在這種條件下再檢測一次。目前六十八頁\總數一百二十頁\編于十點如化合物未與靶蛋白結合，它的NMR譜仍可以被檢測到；如化合物與靶蛋白結合，就會成為蛋白的一部分，其核的弛豫時間就會縮短而無法檢測到它的NMR譜。根據加入靶蛋白前后NMR譜的差異可計算出化合物與靶蛋白的結合率。這種篩選方法不僅可篩選純化合物，而且還可篩選混合物，不管是天然提取的還是組合化學合成的多組分樣品都可不經分離直接進行測定。目前六十九頁\總數一百二十頁\編于十點報告配體篩選方法（reporterligandscreening）可在一定程度上克服LDBS方法的缺陷。該方法的原理是在篩選樣品中加入一個已知能與藥靶某一區域具有弱結合的分子，稱為報告配體或探針。篩選樣品中的片段分子可競爭性地與報告配體結合藥靶，親和力高于報告配體的片段分子被檢測出來。這種方法篩選得到片段與報告配體結合到藥靶相同的區域，避免檢測到與藥靶的非功能區域結合的片段，有效降低了假陽性，具有特異性高的特點。目前七十頁\總數一百二十頁\編于十點2.檢測靶點的篩選TDBS法的原理是當小分子與靶蛋白結合后，會改變蛋白質結合位點的局部化學環境，通過15N標記蛋白的二維N15和H1異核單量子相關譜（2Dheteronuclearsinglequantumcorrelationspectra，HSQC），可以找出各酰胺信號15N或1H的化學位移變化。采用TDBS法的先決條件是必須知道靶蛋白的結構，要求靶蛋白需進行15N標記，這樣才能保證靶蛋白NMR譜能準確識別每個酰胺結合位點的特征峰。目前七十一頁\總數一百二十頁\編于十點TDBS法不僅可用于校正高通量篩選的假陽性結果，確保測試化合物結合在準確的部位；還可指導新化合物的設計，即把相鄰的幾個結合于靶蛋白活性位點亞區域的低親和性配體片段，通過優化組裝連接，就可設計得到所期望的高親和性配體。另外TDBS法還可用于功能未知的新靶蛋白的篩選。目前七十二頁\總數一百二十頁\編于十點TDBS法的優點是準確度高、特異性強，可獲得靶蛋白結合位點的結構信息。但是，TDBS法在技術上還有很大的局限性，目前它僅適用于分子量小于40000的靶蛋白，靶蛋白要進行N15標記，而且要能制備200mg以上的量，因此其應用受到一定限制。目前七十三頁\總數一百二十頁\編于十點3.磁共振構效關系研究法

SAR-by-NMR法由Fesik小組提出，是目前應用最廣的NMR篩選方法。首先，通過二維15N-HSQC譜中15N或1H的化學位移的變化來檢測是否有小分子與靶蛋白結合。然后通過對作用于每個亞區域的片段進行優化和重新組裝便得到所期望的高親和性配體。目前七十四頁\總數一百二十頁\編于十點Shuker等采用SAR-by-NMR法發現了親和力達nmol級的FK506蛋白抑制劑。SAR-by-NMR發現FK506蛋白抑制劑

目前七十五頁\總數一百二十頁\編于十點（二）質譜技術質譜檢測技術分為非共價結合方法和共價結合方法。電噴霧電離質譜是非共價結合檢測的代表方法，Tether技術是共價結合檢測的代表方法。目前七十六頁\總數一百二十頁\編于十點1.電噴霧電離質譜方法

（1）電噴霧電離質譜方法的原理非共價結合方法指活性片段和靶蛋白之間靠氫鍵、范德華力、疏水作用等弱結合力形成片段-靶蛋白復合物，一般借助電噴霧電離質譜（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）進行分析和檢測。目前七十七頁\總數一百二十頁\編于十點（2）電噴霧電離質譜方法的應用細菌23SrRNA的U1061A功能域是一個抗菌靶點，Criffey等采用SAR-by-MS成功發現了高親和力的配體。目前七十八頁\總數一百二十頁\編于十點SAR-by-MS方法發現細菌U1061A功能域配體目前七十九頁\總數一百二十頁\編于十點2.Tether方法（1）Tether技術的原理Tether技術的原理是靶蛋白的半胱氨酸殘基巰基與連有二硫鍵側鏈的片段形成新的二硫鍵。Tether技術由Sunesis公司發明，它是借助質譜識別片段來指導藥物設計。Tether技術不僅能檢測片段和靶蛋白是否結合，而且能夠檢測是否結合在特定的位點。目前八十頁\總數一百二十頁\編于十點一般來說，應用Tether方法篩選的含有二硫鍵片段由三個部分組成：片段母體、連接基團和離去基團（一般為2-巰基乙胺）。Tether方法的原理目前八十一頁\總數一百二十頁\編于十點此外，通過二次Tether技術檢測識別連接毗鄰位點的活性片段，然后將連接兩個片段的二硫鍵以合適的連接子替換，就能得到高活性的化合物。二次Tether方法的原理目前八十二頁\總數一百二十頁\編于十點（2）Tether技術的優點與缺點優點：片段與藥靶之間形成了穩定并且可逆的二硫鍵，通過熱力學平衡原理，用質譜快速檢測得到與藥靶具有較好契合的片段，降低了假陽性率。片段與藥靶形成二硫鍵后有利于開展分子模擬研究或者測定復合物的晶體結構，從而精確定位片段在藥靶活性位點的位置，指導片段的優化或者連接。目前八十三頁\總數一百二十頁\編于十點缺點：需要用定點突變的技術在藥靶活性位點引入半胱氨酸殘基，增加了實驗難度。目前八十四頁\總數一百二十頁\編于十點（3）Tether技術的應用實例——β-淀粉樣前體蛋白裂解酶-1抑制劑的發現β-淀粉樣前體蛋白裂解酶-1（β-amyloidprecursorproteincleavageenzyme，BACE-1）是治療老年癡呆癥的重要靶點。目前八十五頁\總數一百二十頁\編于十點（4）二次Tether方法的原理及應用二次Tether方法（tetheringwithextenders）的原理是用一個已知的活性片段對靶蛋白進行共價修飾，然后將片段潛在的另一個巰基游離出來，用Tether方法去結合新的片段。目前八十六頁\總數一百二十頁\編于十點在起始階段對靶蛋白共價結合的活性片段可以是由Tether方法篩選得到，也可以是通過其他手段發現的，一般具有中度的親和力。然后，將片段脫保護，游離出巰基，再次用前述的Tether方法篩選含有二硫鍵的片段庫，通過形成新的二硫鍵來識別得到結合在藥靶毗鄰位點的第二個活性片段。最后，將連接兩個片段的二硫鍵以合適的連接子替換，就能得到了高活性的化合物。目前八十七頁\總數一百二十頁\編于十點利用二次Tether方法發現高活性的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抑制劑。目前八十八頁\總數一百二十頁\編于十點3.X-射線單晶衍射技術X-射線單晶衍射技術（X-raycrystallography）是研究分子結構最有效和最精確的方法。早期的X-射線單晶衍射技術比較落后，測定蛋白質晶體結構耗時久、精確度低，不利于大量分子的篩選。隨著X-衍射實驗技術、儀器自動化程度和計算機技術的高速發展，采用X-射線單晶衍射技術測定蛋白質或蛋白質-配體復合物的晶體結構正趨向成熟，目前已經有60000余個蛋白質晶體結構被測定。目前八十九頁\總數一百二十頁\編于十點通過共結晶（co-crystallization）和結晶浸潤（soaking）技術，靶蛋白可以快速識別并結合活性片段形成復合物，后者的三維結構可通過高通量X-射線衍射技術快速測定，這種方法稱為結晶篩選（crystallographicscreening）。這種方法不僅可以檢測片段是否有結合，而且還能精確地檢測出結合在靶蛋白的具體位置。目前九十頁\總數一百二十頁\編于十點結晶篩選是一種比較理想的基于片段藥物設計方法，它能夠直接測定片段-靶蛋白復合物的三維結構信息，這不僅大大降低了非特異性結合和假陽性發生的概率，而且對后繼的片段優化和連接提供了直接的指導信息。結晶篩選的缺陷在于對技術和儀器要求很高，不僅需建立高通量蛋白質晶體結構測試平臺，而且需要自動化程度較高的實驗機器人。目前九十一頁\總數一百二十頁\編于十點（1）結晶篩選技術的原理用于結晶篩選的片段庫一般含有1000個左右分子。一般含有1000個分子的片段庫，通常可以發現10~50個活性片段，然后從中選擇4~5個片段進行優化。片段選擇主要根據片段與靶蛋白的作用模式，并結合合成可行性。片段優化一般通過構建組合庫，采用組合化學的方法進行平行合成。目前九十二頁\總數一百二十頁\編于十點結晶篩選過程一般分為四個階段結晶篩選的研究流程目前九十三頁\總數一百二十頁\編于十點（2）結晶篩選技術的應用——脾臟酪氨酸激酶抑制劑的發現結晶篩選技術發現新型脾臟酪氨酸激酶抑制劑目前九十四頁\總數一百二十頁\編于十點三、從活性片段到先導化合物的研究方法上文介紹了各種活性片段檢測技術，但是從新藥發現角度而言，發現活性片段僅僅是研究的第一步，將活性片段轉化變為先導化合物甚至是候選藥物才是基于片段藥物設計研究的最終目的。從片段到先導化合物的設計方法主要分為以下三種：片段生長（fragmentgrowth）法、片段連接（fragmentlinking）或片段融合（fragmentfusion）法、片段自組裝（fragmentself-assembly）法。目前九十五頁\總數一百二十頁\編于十點（一）片段生長法片段生長又稱為片段演化（fragmentevolution）或片段加工（fragmentelaboration），其基本原理如下圖所示。片段生長原理目前九十六頁\總數一百二十頁\編于十點1.過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisomeproliferatoractivatedreceptor，PPAR）是治療2型糖尿病的重要靶點，它有三種亞型：PPARα、PPARγ和PPARδ。Plexxikon公司的科研小組利用結晶篩選方法篩選小分子片段庫（分子量在150~350之間），初步篩選得到170個活性片段。目前九十七頁\總數一百二十頁\編于十點目前九十八頁\總數一百二十頁\編于十點2.周期素依賴性蛋白激酶2抑制劑周期素依賴性蛋白激酶2（cyclin-dependentkinase2，CDK2）是細胞周期的重要調控元件，也是癌癥治療的重要靶標。目前九十九頁\總數一百二十頁\編于十點3.凝血因子Ⅹa抑制劑凝血因子Ⅹa（factorⅩa）是治療凝血障礙的重要靶點。目前一百頁\總數一百二十頁\編于十點（二）片段連接與融合片段連接的原理如下圖所示，片段a和b分別作用于靶蛋白的不同活性口袋，且兩個活性口袋毗鄰，將兩個片段用合適的連接基團連接起來得到親和力增強的新分子。片段連接和融合原理目前一百零一頁\總數一百二十頁\編于十點1.Bcl-XL抑制劑

腫瘤的發生與Bcl-2和Bcl-XL的過表達相關。因此，研制Bcl-XL的高效抑制劑對癌癥的治療有重要的意義。目前一百零二頁\總數一百二十頁\編于十點目前一百零三頁\總數一百二十頁\編于十點2.基質金屬蛋白酶抑制劑

基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是抗腫瘤藥物的作用靶點。目前一百零四頁\總數一百二十頁\編于十點3.尿激酶（urokinase）抑制劑的抗腫瘤作用靶點目前一百零五頁\總數一百二十頁\編于十點（三）片段自組裝片段自組裝可以看作是一種自動的片段連接方法，如下圖所示，在片段篩選過程中，分別結合在活性位點中相毗鄰的結合口袋的兩個活性片段a和b含有可相互反應的基團，這兩個片段可自發地反應連接成為高活性的化合物。片段自組裝原理目前一百零六頁\總數一百二十頁\編于十點片段的自組裝一般通過兩種新術實現：點擊反應（clickreaction）和動態組合化學（dynamiccombinatorialchemistry，DCC）。點擊化學的基本思想是利用一些近乎“完美”的化學反應來實現特定構建模塊的快速合成或組裝。動態組合化學將組合化學與分子識別和自我裝配有機結合起來，動態組合化學庫中的片段之間能發生可逆的反應，它們處于一個動態平衡中。目前一百零