人教版高中生物

選擇性必修3第3章基因工程第1課時目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1簡述PCR的原理、條件及過程(重點)。2簡述基因表達(dá)載體的組成及構(gòu)建過程(重、難點)。情境導(dǎo)入1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟?><目標(biāo)一目的基因的篩選與獲取1.1培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的四個步驟與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉

（有抗蟲特性）導(dǎo)入抗蟲基因重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定1.2目的基因的篩選與獲取蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生Bt基因伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)表達(dá)破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)殺死棉鈴蟲導(dǎo)入抗蟲棉培育棉花細(xì)胞用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)基因。主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子1目的基因1.2目的基因的篩選與獲取科學(xué)家已經(jīng)明確Bt基因的序列信息，也對Bt抗蟲蛋白有深入了解利用序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列對比工具（如BLAST）等，找到合適的目的基因2篩選合適的目的基因從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選目的基因1.2目的基因的篩選與獲取①通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因②人工合成目的基因③利用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因前提：方法：DNA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成3獲取目的基因的方法1.2目的基因的篩選與獲取提取？蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因快速獲得大量抗蟲基因4利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因1.2目的基因的篩選與獲取發(fā)明者：穆里斯4利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，通過在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。（1）PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的概念、原理1.2目的基因的篩選與獲取耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液四種脫氧核苷酸(dNTP)（2）基本條件一般添加Mg2+（激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶）引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸dATP與ATP在結(jié)構(gòu)上有什么區(qū)別？dATP為什么能用作DNA復(fù)制的底物？如圖所示，ATP結(jié)構(gòu)中的五碳糖為核糖，而dATP結(jié)構(gòu)中的五碳糖為脫氧核糖。ATP轉(zhuǎn)移掉兩個磷酸基團(tuán)后剩下的結(jié)構(gòu)就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是轉(zhuǎn)錄的底物；同理，dATP轉(zhuǎn)移掉兩個磷酸基團(tuán)后剩下的結(jié)構(gòu)就是腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA復(fù)制的底物。1.2目的基因的篩選與獲取3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈（3）PCR反應(yīng)過程

3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’1.2目的基因的篩選與獲取第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪循環(huán)的產(chǎn)物1.2目的基因的篩選與獲取（4）PCR的結(jié)果：由于一個循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式擴(kuò)增（約為

，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。指數(shù)2n（5）PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。變性90℃以上延伸72℃左右復(fù)性50℃左右基本過程1.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段？比例是多少？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’第3輪；1/4。活動1分析PCR擴(kuò)增技術(shù)2．圖2是某同學(xué)設(shè)計的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)，都不合理，請分別說明理由。（1）第1組：

；

第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ會因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對而失效引物Ⅰ′自身折疊后會因出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對而失效活動1分析PCR擴(kuò)增技術(shù)3．要保證目的基因能與載體相連接，還要對引物進(jìn)行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識別序列。4．如果循環(huán)n次，則共需消耗多少對引物？共需消耗2n－1對引物。活動1分析PCR擴(kuò)增技術(shù)1.比較PCR擴(kuò)增技術(shù)和體內(nèi)DNA復(fù)制的異同項目體內(nèi)DNA復(fù)制PCR擴(kuò)增技術(shù)解旋方式解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋場所細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))PCR擴(kuò)增儀內(nèi)酶解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶溫度條件細(xì)胞內(nèi)溫和條件需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行結(jié)果DNA分子DNA片段或目的基因相同點(1)模板：均需要DNA的兩條單鏈作為模板；(2)原料：均為4種脫氧核苷酸；(3)酶：均需DNA聚合酶2.PCR中的數(shù)量關(guān)系復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物的DNA分子數(shù)2482n含其中一種引物的DNA分子數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同時含兩種引物的DNA分子數(shù)0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的對數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數(shù)0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n1.下列有關(guān)PCR技術(shù)的說法，錯誤的是A.PCR是一項在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)B.PCR技術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)制C.PCR的特異性主要取決于引物的堿基序列特異性D.PCR擴(kuò)增中需要解旋酶解開雙鏈DNA√解析引物的堿基序列特異性決定了PCR的特異性，C正確；PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA受熱變性后解聚為單鏈，不需要解旋酶解開雙鏈DNA，D錯誤。2.(2022·福建寧德高二期中)通過設(shè)計引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實現(xiàn)目的基因的定點誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5′端分別設(shè)計增加限制酶a和限制酶b的識別位點。下列有關(guān)敘述不正確的是A.引物中設(shè)計兩種限制酶識別位點有利于目的基因定向插入B.復(fù)性溫度過高會導(dǎo)致引物不能與模板牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增

效率下降C.第3輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的

突變基因D.第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2√解析引物中設(shè)計兩種限制酶識別位點，可以配合載體的限制酶識別位點，幫助目的基因定向插入載體，避免發(fā)生自身連接，A正確；PCR技術(shù)中，復(fù)性溫度過高會導(dǎo)致引物不能與互補(bǔ)DNA鏈(模板)牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增效率下降，B正確；第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA只有1個，而子代DNA有23＝8(個)，故含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/8，D錯誤。><目標(biāo)一基因表達(dá)載體的構(gòu)建一邊閱讀，一邊完成學(xué)案上的表格活動2分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法不能。游離的DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，即使可以轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。1.獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞呢？因此，獲取Bt基因后，還需要借助載體將其導(dǎo)入棉花細(xì)胞，才能使棉花植株獲得抗蟲特性。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。1基因表達(dá)載體的目的2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建2基因表達(dá)載體的組成人們所需要的基因作用：便于重組DNA分子的篩選位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片斷）終止轉(zhuǎn)錄位置：功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。基因的上游（一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段）2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖3基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一邊閱讀，一邊完成學(xué)案上的表格活動2分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法啟動子下游和終止子上游。因為只有插入在啟動子和終止子之間，目的基因才可以正常表達(dá)。2.構(gòu)建基因表達(dá)載體時目的基因插入的位置應(yīng)該在哪里？為什么？一邊閱讀，一邊完成學(xué)案上的表格活動2分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因為SmaⅠ切割會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。3.請結(jié)合下圖，回答問題：質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進(jìn)一步篩選。一邊閱讀，一邊完成學(xué)案上的表格活動2分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法（2）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點是什么？3.請結(jié)合下圖，回答問題：①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。1.區(qū)分啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達(dá)載體必需的部分，而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束。2.圖解限制酶的選擇原則如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。不破壞目的基因原則：①保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：②2.圖解限制酶的選擇原則通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（或為了保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接）可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒。確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：③思維拓展1.原核基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)翻譯轉(zhuǎn)錄mRNA蛋白質(zhì)思維拓展2.真核基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)加工轉(zhuǎn)錄mRNA前體成熟mRNA外顯子內(nèi)含子翻譯蛋白質(zhì)3.(2022·江蘇宿遷高二期中)下列有關(guān)抗蟲基因表達(dá)載體的敘述，正確的是A.切割含抗蟲基因的DNA片段和載體必須用同一種限制酶B.抗蟲基因表達(dá)載體中要有啟動子和終止密碼子C.抗蟲基因表達(dá)載體必須具備標(biāo)記基因，其作用是篩選含有目的基因的受體細(xì)胞D.抗蟲基因的表達(dá)啟動于復(fù)制原點√解析切割含抗蟲基因的