高通量測序簡介第1頁/共42頁主要內(nèi)容一、高通量測序簡介二、Solexa和Semiconductor測序原理三、高通量測序部分應用第2頁/共42頁高通量測序（High-throughputsequencing）又稱“下一代”測序（“Next-generation”sequencing），可一次性對幾百萬到十億條DNA分子進行并行測序；可以對一個物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組進行深入、細致和全貌的分析，所以又被稱為深度測序（Deepsequencing）。

一、高通量測序簡介第3頁/共42頁高通量測序的發(fā)展1992年LynxTherapeuticsMPSS2003年PolonySequencing(哈佛）2005年454Pyrosequencing2006年SolexaSequencing-By-Synthesis2007年ABISOLID2008年HelicostSMSSequencing2009年IonTorrentSemiconductorSequencing2011年PicficBiosciencesSMRTSequencing第4頁/共42頁高通量測序的主要代表平臺有:羅氏的(Roche)的454測序儀（RocheGSFLXsequencer）;Illumina的Solexa基因組分析儀（IlluminaGenomeAnalyzer）;ABI的SOLiD測序儀（ABISOLiDsequencer）;ThermoFisher的離子半導體測序儀（IonSemiconductorsequencer).第5頁/共42頁Illuminasolexa文庫制備二、Solexa和Semiconductor測序原理第6頁/共42頁Lane1Lane2Lane8...TileEachlanecontains2columnsEachcolumncontains60tilesEachtileisimaged4

timespercycleFlowcell第7頁/共42頁簇生成，模板變性OHOHflowcelldiol

P7

P5dioldiolTemplatehybridizationdioldiolInitialextensiondioldiolDenaturation第8頁/共42頁橋式擴增dioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=301stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionclusters第9頁/共42頁并行合成測序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端終止技術(shù)（ReversibleTerminatorChemistry）CAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’ FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents DetectSignal CleaveTerminatorandDyeCycle2-n:Addsequencingreagents andrepeat第10頁/共42頁信號收集第11頁/共42頁讀取堿基序列在測序過程中，每種堿基被激發(fā)后都會發(fā)出特殊波長的熒光在每個循環(huán)過程中每一個簇只對應一張圖像第12頁/共42頁測序通量讀

長測序時長數(shù)據(jù)量2×150bp~29h100-200GB2×75bp18h50-80GB1×75bp11h25-30GB適用范圍全基因組測序、全外顯子測序、轉(zhuǎn)錄組測序特

點高通量、靈活性、簡便NextSeq500測序通量讀

長測序時長數(shù)據(jù)量2×75bp~24h3.3-3.8GB2×150bp~24h4.5-5.1GB2×250bp~39h7.8-8.5GB2×300bp~55h13.2-15GB適用范圍靶向測序、小基因組測序、靶向基因表達分析特

點唯一一臺在單次運行產(chǎn)生2x300bp雙端reads的測序儀。MiSeqIllumina測序平臺展示第13頁/共42頁測序通量讀

長測序時長數(shù)據(jù)量2×150bp1-3.5d1300-1500GB1×75bp650-750GB1×50bp215-250GB適用范圍全基因組測序、全外顯子測序、轉(zhuǎn)錄組測序特

點最高的通量，每個樣品的最低價格測序通量讀

長測序時長數(shù)據(jù)量2×150bp<3d單流動槽

雙流動槽8-9TB16-18TB適用范圍全基因組測序特

點超高的通量，有望突破人類全基因組測序的$1000大關Hiseq4000HiSeqXTen第14頁/共42頁NovaSeq6000流動槽類型S1S2S3S4數(shù)據(jù)量a1×50bp167GB280-333GBN/AbN/Ab<19h1×75bp333GB560-667GBN/AbN/Ab<29h2×150bp500GB850-1000GB2000GB3000GB<40h適用范圍全基因組測序、靶向重測序、轉(zhuǎn)錄組測序特

點對幾乎任何基因組、任何測序方法和規(guī)模的項目，都有可擴展的通量，靈活簡便。所有產(chǎn)出和read數(shù)量規(guī)格都基于單個流動槽計算，NovaSeq6000系統(tǒng)可同時運行1個或2個流動槽。b.N/A:不適用。第15頁/共42頁

IonSemiconductor測序流程第16頁/共42頁PCR產(chǎn)物純化文庫制備第17頁/共42頁接頭連接第18頁/共42頁片段篩選第19頁/共42頁樣本混池第20頁/共42頁克隆擴增第21頁/共42頁不理想的擴增情況第22頁/共42頁ISP富集（IonSphereParticalEnrichment）擴增引物的5’端標記了生物素,通過鏈霉親和素標記的磁珠與標記了生物素的DNA結(jié)合.第23頁/共42頁測序自然情況下，DNA聚合酶將一個核苷酸滲入到DNA分子中就會釋放出一個H+，導致局部可檢驗的PH值發(fā)生變化，被離子傳感器檢測到，從而轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。第24頁/共42頁堿基識別依次摻入4中堿基連續(xù)兩個相同堿基結(jié)合第25頁/共42頁IonTorrentPGMIonTorrent儀器展示Chip類型PGM314PGM316PGM318傳感器數(shù)1.3M6.3M11M數(shù)

據(jù)

量~100MB~1GB~2GB運行時間2.3/4.7h3.0/4.9h4.4/7.3h讀

長200/400bp200/400bp200/400bp應用范圍擴增子測序、靶向重測序、小基因組測序特

點基于半導體技術(shù)測序原理，快速“讀”出堿DNA序列第26頁/共42頁高通量測序DNA全基因組測序人基因組重測序動植物基因組測序微生物基因組測序外顯子組測序全外顯子組測序靶向捕獲測序（panel）甲基化測序擴增子測序RNAmRNA測序LncRNA測序SmallRNA測序CircularRNA測序三、高通量測序部分應用第27頁/共42頁全基因組測序全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，通過序列比對，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點（SNP），插入缺失位點（InDel）、結(jié)構(gòu)變異位點（SV）位點和拷貝數(shù)變異位點（CNV)。全基因組denovo測序是指對未知基因組序列的物種進行從頭測序，用生物信息學分析方法進行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組序列圖譜。第28頁/共42頁基因組測序策略第29頁/共42頁外顯子組測序外顯子組一個物種基因組中全部外顯子區(qū)域的總和；人外顯子組只占基因組的~1%，約30Mb；約85%的人類致病突變都位于這1%的蛋白質(zhì)編碼序列上。第30頁/共42頁文庫構(gòu)建Nimblegen、AgilentIllumina第31頁/共42頁mRNA測序(mRNAseq)是指利用高通量測序技術(shù)對cDNA進行測序從而得到一個樣品中基因表達、cSNP、全新的轉(zhuǎn)錄、全新異構(gòu)體、剪接位點、等位基因特異性表達和罕見轉(zhuǎn)錄等最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。mRNA測序第32頁/共42頁文庫構(gòu)建擴增文庫通過帶oligoT的磁珠分離出mRNA第33頁/共42頁LncRNA是一類長度超過200nt的長鏈非編碼RNA，通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等水平調(diào)控基因表達。lncRNA測序是研究已有參考基因組物種的特定組織或細胞在某個特定時期轉(zhuǎn)錄出的所有l(wèi)ncRNA和mRNA。LncRNA（longnoncodingRNA)測序第34頁/共42頁文庫構(gòu)建第35頁/共42頁SmallRNA是長度約20-30nt的非編碼RNA分子，主要包括miRNA、siRNA、piRNA等，是生命活動重要的調(diào)控因子，在基因表達調(diào)控、生物個體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等生理過程中起著重要的作用。SmallRNA測序第36頁/共42頁文庫構(gòu)建第37頁/共42頁CircRNA是mRNA在剪接的過程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀RNA分子。近年的研究表明，circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點，在細胞中起到miRNA海綿的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平；這一作用機制被