內容基本概念試驗方法操作注意事項內毒素實驗凝膠法專家講座第1頁細菌內毒素細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁產物,它主要化學成份是脂多糖。細菌在生活狀態下不會釋放出來，只有當細菌死亡后才會表現出毒性。內毒素實驗凝膠法專家講座第2頁一、概念及相關知識熱原反應：病人在靜脈給藥15分鐘后發生冷感、寒戰、發燒、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。熱原：任何能夠造成肌體發燒物質。機理：外源性熱原質經過內源性熱原質起作用。外源性熱原質吞噬性白細胞內源性熱原質體溫調整中心發熱新蛋白合成新mRNA翻譯內毒素實驗凝膠法專家講座第3頁1942年，美國藥典首次收載熱原檢驗法，中國藥典自第一版（1953年版）起收載。全部注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經過熱原檢驗。熱原檢驗法不足：1、重現性差。2、對藥品引發增加、抑制作用無法控制。3、不一樣細菌產生熱原質致熱域有差異。4、非定量反應。即使不排除有其它熱原物質存在，但細菌內毒素是最主要熱原物質。內毒素實驗凝膠法專家講座第4頁細胞壁結構：肽聚糖脂蛋白革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌外膜磷壁酸脂多糖細菌內毒素：革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中脂多糖（LPS）。當細胞壁外膜結構完整時不具備生物活性，只有當細菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內毒素活性。脂多糖結構：多糖O抗原＋關鍵多糖＋類脂A致熱活性部分內毒素實驗凝膠法專家講座第5頁細菌內毒素生物活性

1、致熱性。2、致死性毒性。3、白細胞降低。4、激活凝血系統。5、降低血壓，休克。6、Shwartzman反應。7、刺激淋巴細胞有絲分裂，等等。內毒素實驗凝膠法專家講座第6頁細菌內毒素耐熱性細菌內毒素具很強耐熱性，普通高壓滅菌不能去除細菌內毒素，需250℃最少30分鐘以上干熱滅菌才能使其滅活。

內毒素實驗凝膠法專家講座第7頁試驗用器具處理

內毒素試驗中使用器皿都要經過處理去除可能存在外源性內毒素。耐高溫玻璃器皿等置于電熱干烤箱內180℃干烤最少2h或者250℃干烤最少30分鐘；塑料器皿置于30％雙氧水中浸泡4h，再用細菌內毒素檢驗用水充分沖洗，60℃烘干備用。

內毒素實驗凝膠法專家講座第8頁細菌內毒素單位內毒素量值：1、內毒素單位（EU）1982年FDA將當初美國代號為EC－2內毒素標準品要求為5EU/ng。1983年內毒素單位（EU）被USP正式引用。2、國際單位（IU）WHO先后兩次組織協作標定，建立內毒素國際標準品，其中第二批內毒素國際標準品適合用于全部內毒素檢驗法，且明確1IU＝1EU。內毒素實驗凝膠法專家講座第9頁細菌內毒素檢驗法凝膠法濁度法光度法顯色基質法重現性好能定量能控制藥品增強/抑制干擾操作簡便。節約時間方法分類方法特點內毒素實驗凝膠法專家講座第10頁細菌內毒素檢驗法概念本方法是利用鱟試劑檢測由革蘭氏陰性菌產生細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素限量是否符合要求一個方法。細菌內毒素檢驗法包含凝膠法和光度測定法，因為凝膠法操作簡單快捷、靈敏度高，而且藥典要求當不一樣試驗方法結果存在爭議時，除另有要求外，以凝膠法為準，所以凝膠法被廣泛應用。內毒素實驗凝膠法專家講座第11頁鱟：一個古老棲身于沿海海洋生物，節肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中變性細胞，經裂解液和機械方式促使細胞破裂而提取到一個細胞溶解物，能與極微量細菌內毒素形成特異凝膠反應，反應速度和凝膠堅固程度與內毒素濃度相關，是體外檢測內毒素敏感試劑。內毒素實驗凝膠法專家講座第12頁內毒素實驗凝膠法專家講座第13頁凝膠法概念

凝膠法是經過鱟試劑與內毒素產生凝集反應原理來檢測或半定量內毒素方法。內毒素實驗凝膠法專家講座第14頁鱟試劑與內毒素反應機理內毒素C因子活化C因子凝膠B因子凝固酶原凝固酶活化B因子凝固蛋白原鱟凝血系統－酶聯反應內毒素實驗凝膠法專家講座第15頁二、細菌內毒素凝膠法試驗程序1、試驗準備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復核4、供試品干擾試驗（新藥或新方法）5、供試品內毒素限量檢驗內毒素實驗凝膠法專家講座第16頁凝膠法中用到儀器

1.超凈工作臺

內毒素實驗凝膠法專家講座第17頁凝膠法中用到儀器2.恒溫培養箱

孵育樣品浸提液以及培養試驗結果。內毒素實驗凝膠法專家講座第18頁凝膠法中用到儀器3.干烤箱

用于試驗用耐高溫器皿去熱源，溫度范圍要求最少300℃內毒素實驗凝膠法專家講座第19頁凝膠法中用到儀器4.移液器和無熱源移液尖（或者去熱源刻度吸管）

5.計時器、漩渦混合器、電子天平等內毒素實驗凝膠法專家講座第20頁凝膠法中用到器皿器具分類器具名稱反應試管玻璃試管（外徑10×75mm）、試管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭其它酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號筆內毒素實驗凝膠法專家講座第21頁凝膠法中用到試劑

1）鱟試劑：含有國家頒發同意文號2）細菌內毒素工作品3）細菌內毒素檢驗用水（內毒素含量小于0.015EU/ml無菌水）

4）75％乙醇內毒素實驗凝膠法專家講座第22頁鱟試劑靈敏度復核試驗

當使用新批號鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

內毒素實驗凝膠法專家講座第23頁鱟試劑靈敏度復核試驗

依據鱟試劑靈敏度標示值（λ）,將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢驗用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘,然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四個濃度內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。內毒素實驗凝膠法專家講座第24頁鱟試劑靈敏度復核試驗

取復溶后0.1ml/支規格鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不一樣濃度內毒素標準溶液，每一個內毒素濃度平行做4管；另外2管各加入0.1ml細菌內毒素檢驗用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

內毒素實驗凝膠法專家講座第25頁鱟試劑靈敏度復核試驗結果觀察

將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°時，若管內形成凝膠，且不從管壁滑脫者為陽性；若不形成凝膠，或形成凝膠但倒轉180°后從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應防止受到振動造成假陰性結果。

內毒素實驗凝膠法專家講座第26頁鱟試劑靈敏度復核試驗

若最大濃度2.0λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。計算反應終點濃度幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度測定值（λc），計算方法見中國藥典。反應終點濃度是指系列遞減內毒素濃度中最終一個呈陽性結果濃度。當λc在0.5λ～2.0λ（包含0.5λ和2.0λ）時，方可用于細菌內毒素檢驗，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑靈敏度。

內毒素實驗凝膠法專家講座第27頁凝膠法試驗步驟

下面我們結合中國藥典、GB14233.2醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法以及GB15810一次性無菌注射器來學習詳細試驗方法。

內毒素實驗凝膠法專家講座第28頁試驗步驟

浸提介質（細菌內毒素檢驗用水）體積計算公告：V－－浸提介質體積，單位為（ml）；L－－產品細菌內毒素限值（該產品允許含有細菌內毒素量），單位為EU/件；λ－－鱟試劑靈敏度標示值，單位為EU/ml。內毒素實驗凝膠法專家講座第29頁試驗步驟樣品處理方法：

a）管類和容器類器具用細菌內毒素檢驗用水浸泡器具內腔，在（37±1）℃恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進行試驗；b）小型配件或實體類樣品置無熱源玻璃器皿內，加入細菌內毒素檢驗用水振蕩數次，在（37±1）℃恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進行試驗。制備供試液儲存不應該超出2h。普通要求供試液PH值在6.0~8.0之間，如不在該范圍內，可用鱟試劑廠家提供PH緩沖液調整浸提液PH值。內毒素實驗凝膠法專家講座第30頁試驗步驟內毒素實驗凝膠法專家講座第31頁結果觀察

B、C溶液反應管必須要陽性，就是輕輕倒轉180度過來，鱟試劑安瓿里反應溶液形成了凝膠體，不滑落。而D溶液，就是細菌內毒素檢驗用水那2管，必須要陰性，3個條件都滿足，就說明試驗結果是可信。最終看A溶液反應情況：陽性就說明原套器具每件大于20EU，判定為不合格；陰性就說明小于20EU,結果是合格；1管陽性、1管陰性則要重新復查，復試時，溶液A需做4支平行管，若全部平行管均為陰性則判斷合格；不然判斷為不合格。內毒素實驗凝膠法專家講座第32頁注意事項1.每批鱟試劑在用于試驗前首先要進行靈敏度復核試驗；2.安瓿開啟前應先用砂石劃痕(不論是色點或包環易折安瓿)，用手半拉半掰將頸部折斷，千萬不能用鑷子敲擊，預防碎玻屑掉入安瓿。3.在鱟試劑溶解、樣品稀釋及加入時，取樣均應準確，緩緩加入防止氣泡。

4.保溫過程中不可隨時取出觀察，預防形成凝膠受到振動后變形而誤判為陰性。

內毒素實驗凝膠法專家講座第33頁注意事項5.凍干鱟試劑應存放在2-8℃下；防止長時間放置在高于25℃溫度條件下。已復溶鱟試劑在間歇使用過程中最好放在2-8℃冰箱里，可存放24小時，在-20℃以下，可存放四個星期，鱟試劑只能凍融一次。

內毒素實驗凝膠法專家講座第34頁三、操作注意事項試驗前準備：1、玻璃器具應規范化，便于除熱原、計量準確、清洗操作方便。洗凈去污去內毒素去洗滌劑精洗除外源性熱原：250

℃干烤最少1小時。2、盡可能用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后250

℃干烤最少1小時。3、用于內毒素檢測稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且確保無內毒素。內毒素實驗凝膠法專家講座第35頁試驗環境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內進行，確保環境溫度、濕度及通風穩定。試驗人員：用適宜洗滌劑洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。試驗過程：1、內毒素工作標準品應嚴格按要求低溫保留；工作標準品開封后盡快使用且應一次性用完，不再保留。2、溶解后標準品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；深入稀釋時每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30s。內毒素實驗凝膠法專家講座第36頁內毒素實驗凝膠法專家講座第37頁振蕩前振蕩后內毒素分子在水溶液中狀態內毒素實驗凝膠法專家講座第38頁3、每一步稀釋液所用移液器不能重復、交叉使用。4、鱟試劑復溶時應將檢驗用水順著瓶壁加入，防止產生氣泡。5、操作時間長短。環境溫度改變都會影響試驗結果，故