10-液相色譜串聯質譜聯用技術-實驗指導（許煊煒）譜指儀檢尊術（2014、2015級）課程內容（一個實驗8學時）：（1）ABSciexQtrap4500三重四級桿/離子阱液相色譜串聯質譜聯用儀的結構原理、操作及定性定量應用。（2）利用液相色譜串聯質譜聯用儀快速測定水果中7種農藥的殘留量。吉林農業大學農業部參茸質檢中心2017.03實驗一ABSciexQtrap4500三重四級桿/離子阱液相色譜串聯質譜聯用儀的結構原理、操作及定性定量應用一.實驗目的和意義通過學習液質聯用儀的構成和使用方法，及其在定性、定量分析中的應用，培養學生使用液質聯用儀進行儀器分析的能力，并培養學生嚴謹的科學態度、細致的工作作風、實事求是的數據報告和良好的實驗習慣（準備充分、操作規范，記錄簡明，臺面整潔、實驗有序，良好的環保和公德意識）。培養培養學生的動手能力、理論聯系實際的能力、統籌思維能力、創新能力、獨立分析解決實際問題的能力、查閱手冊資料并運用其數據資料的能力以及歸納總結的能力等。（一）檢測儀器1、儀器名稱高效液相色譜串聯質譜聯用儀（簡稱13^5-乂5）。型號：4500QTRAP（美國AppliedBiosystems公司）。2、儀器組成液相色譜部分：島津LC-30A，配有在線脫氣機、超高壓二元泵、自動進樣器；串聯質譜部分：QTRAP4500，配有ESI離子源、串聯

四級桿/線性離子阱。3、主要性能指標離子化方式：ESI電離質量范圍：（5~1700量范圍：（5~1700）amu分辨率：＞6900質量穩定性：0.1amu/12h靈敏度：1pgreserpine,ESI+,MRM掃描(m/z:609/195)，信噪比S/N>120:1掃描速度：4000amu/sec質量準確度：<0.01%(全質量數范圍）4、方法原理高效液相色譜二元泵將流動相泵人系統并混合，自動進樣器將待測樣品注入流動相中，隨流動相進入色譜柱，由于樣品不同組分在色譜柱中保留時間不同,各組分被分開，依次進入離子源。在離子源中，各組分以ESI或APCI方式電離，被加速后進入質量分析器。4500QTRAP的質量分析器主要由Q1、Q2、Q3三組四級桿串聯組成。Q1可將分子離子按質荷比（m/z）大小分開；Q2是碰撞室,可將母離子進一步破碎為碎片離子；Q3具有四級桿和線性離子阱兩種功能，作為四級桿時可將分子離子或碎片離子按質荷比大小分開，作為離子阱還可富集離子從而提高檢測靈敏度。各組分的不同離子在質量分析器中被破碎、分離，并按質荷比大小依次抵達監測器，經記錄即得到按不同質荷比排列的離子質譜圖。4500QTRAP通過串聯四級桿/線性離子阱兩種

不同質譜技術的結合，可以在單次分析中對復雜樣本中的單個成分同時進行定性和定量，也可以對多個化合物進行定量分析。整臺儀器的控制、數據采集、數據處理、結果輸出均由PC計算機Windows操作系統支持下的Analyst軟件控制完成。（二）樣品1、樣品要求本儀器適合分子量在5~1700amu范圍內的有機樣品的定性及定量分析。待測樣amu范圍內的有機樣品的定性及定量分析。待測樣品必須能溶解于水或其它有機溶劑中。若樣品或配制的樣品溶液發生沉淀、揮發、變質等異常現象時，應重新取樣或重新配制溶液。2、試劑要求所有的試劑均選用色譜純級，所用水的電導率應大于18KQ。流動相必須用0.2|im或0.45Nm濾膜過濾后方可使用。3、分離條件要求在液相色譜儀上確定分離條件，使待測組分能完全分離，且該色譜條件中流動相不應含有不揮發性鹽，如磷酸鹽。（三）、操作步驟實施檢測操作的人員，必須熟悉該儀器的操作規程，儀器的工作狀態、包括檢測靈敏度和分辨率，必須滿足檢測項目的要求。1、開機前準備開機前應檢查儀器室內電、氣的供應情況及空調機的工作狀態是否穩定，檢查真空機械泵泵油是否需要更換。只有當UPS工作正常，Gas1/Gas2、CurtainGas和ExhaustGas的壓力分別穩定在0.35、0.35和0.7Mpa,環境溫度為10?30℃,相對濕度小于70%時才能開機。2、開機1）打開真空機械泵上的電源開關。2）真空機械泵繼續工作至少15分鐘后，打開MS電源主開關。3）等真空度達到2X10-5Torr（綠色指示燈不閃）后，打開PC計算機電源3、儀器調諧（四）、方法建立.在Analyst軟件Tools菜單中選擇Project-CreateProjecto在Projectname項下輸入新建的Project名稱。注意，不要點選窗口中的其他按鈕！點擊OK,確認新建Projecto.在Analyst軟件界面下，雙擊導航欄內HardwareConfiguration。在彈出窗口中選擇MassOnly,點擊ActivateProfile,激活MassOnly（只聯接質譜主機）。.在導航欄內單擊如neandCalibrate,進入調諧模式。點擊上方工具條中的T鈕。此時，應注意到主機有“撲”聲音，表明進入調諧狀態。此時右下角質譜狀態顯示綠色。雙擊ManualTuning進入質譜

參數設置及運行窗口。.使用1mL玻璃進樣針吸取適當標準溶液，置于進樣針座上。點擊MSMethod下拉菜單，選擇SyringePumpMethod，設定針泵流速FlowRate為10pL/min。.點擊StartSyringePump按鈕開針泵進樣。.返回MSMethod，選擇掃描模式ScanType為Q1MS，設定掃描速度ScanRate為10Da/s，設定掃描范圍Start—描范圍Start—DP預輸入60。Stop設定為50化合物分子量。.點擊start開始采集數據。運行穩定后，注意觀察是否有預期的母離子出現，并控制其響應值在約E4以下。點擊stop，選擇第一個峰（后面是同位素峰）的平穩段，雙擊，選中母離子。點擊右鍵，選擇DeletePane。.設定Scantype為產物離子掃描ProductIon（Ms2），掃描速度200Da/s，選擇掃描正/負離子,輸入母離子（productof），設定掃描范圍start start stop為50MW+20,覆蓋可能的子離子質量范圍，點擊compoud標簽，設定（DP）60,（CE）5。.點擊start，開始采集數據，注意觀察是否有預期的母離子出現。手動調節CE,以5eV為步長，逐漸增加。每次增加后稍作等待，直至目標化合物的子離子清晰看見。選擇平穩的一段，雙擊，選擇子離子。.選擇ScanType為MRM。設定參數表格中的Q1對應的母離子，Q3對應的子離子，time（ms）為50，ID值設為名稱1（定量），名稱2（定性）。.點擊EditRamp，在Parameter下選擇CollisionEnergy，點擊OK。點擊start開始采集數據，記錄每個MRM通道的最佳CE電壓。在MRM參數設定表中,右鍵點擊。選擇CollisionEnergyCE，調出表格中的CE列，輸入每個MRM通道的最佳CE電壓值，精確到個位數。重復以上步驟，在Parameter項下選擇DeclusteringPotential，優化并保存DP。完成后選擇菜單File/Save保存采樣方法,［文件名］.dam。（五）1_0^方法的建立：1、連接儀器：打開HPLC質譜電源，將HPLC系統接上柱子，將6號出口管線與離子源連好。調離子源噴霧針位置到2mm處，雙擊HardwareConfigure，在硬件配置菜單下單擊LCMS（液相與質譜聯用），單擊Activateprofile激活儀器，會聽到笛的一聲，說明儀器已經連接上。2、確認液質同步：選擇項目（之前優化方法的時候已經建立的項目）；雙擊Buildacquisitionmethod新建方法，彈出新建方法模板。在模板左側點擊acquisitionmethod，模板右邊顯示對應的參數，確認synchronizationmode選擇LCSync,表示液質同步。3、設置MRM參數：點擊方法模板左側的MRM,在模板右側ScanType下選擇MRM；在polarity下選擇化合物極性：Positive（正離子）、Negative（負離子）；Duration為15min（與液相分離相同的時間）;表格中Q1：母離子分子量，Q3（Da）：子離子分子量,Time（msec）：50，ID欄：化合物名稱（離子對名稱后空格加1為定量，空格加2為定性），在表格中右鍵分別單擊DP、CE，點擊工具欄的OPEN打開之前優化的方法參數，調出DP,CE值，選中整行，Ctrl+c（復制）參熟關閉窗口，再Ctrl+v能貼）參數）；最后點擊Editparameter設置離子源參數：Source/Gas項用以下推薦值：CUR35,IS:5500（正離子）或-4500（負離子），TEM600，GS160，GS270，點擊OK。4、設置液相參數：點擊模板左邊的shimadzuLCsystem，①在右邊的pumps欄下,設置stoptime（運

行時間）為15min,flow流速為1mL/min,A為水相設為95%,B為有機相設為5%（設置時改B,A自動），泵最大壓力為50；點擊timeprogram設置液相梯度：例咪唑類梯度設置:Time(min)AB---95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%一②接著在右邊的Autosampler欄下，設置清洗時間，在Rinsemode下選擇Beforeandafter（前后都洗），并設置清洗時間為5s，清洗液用50%甲醇水。最后點擊保存按鈕，在保存窗口輸入該方法的名稱。（五）數據處理雙擊打開Multiquilt，選擇項目，點擊File下的熒光棒型圖標，點擊sample，選擇需要的標準品和樣品數據，點擊next，createnewmethod，為方法命名，點擊next，選擇一個有代表性的樣品（一般選擇濃度較大的標品數據），設置分組（同一物質定量離子和定性離子設置為一組），并指定內標，next，對10

每個物質進行積分。設置積分參數:CausianSmoth（平滑）：一般是0,如有毛刺可改成1或2；ExpecetedTime（保留時間）：一般不動Expectedtime范圍:Expectedtime范圍:4般30s，表示在保留時間±15s范圍最小峰寬最小峰高背景噪音扣除:可調整目標峰基線以下被積分的面積，比例越高積分越往下，必要時調整。分峰因子：峰有分叉時設置，如有兩個分叉，設置為2,峰分叉不能大于2單位：設置單位，勾選Applyunitstoall可將此單位用于所有化合物點擊next，點擊finish。在新跳出窗口內將標準品選定，輸入濃度。查看各化合物積分是否正常，點擊第三個圖標查看標準曲線。11

實驗二利用液相色譜串聯質譜聯用儀快速測定水果中7種農藥

的殘留量1實驗目的:11讓學生了解利用液相色譜質譜聯用儀測定食品、農產品中農藥殘留等有害化合物的分析流程。1.2利用前2節課所學內容實際處理樣品，增強學生實踐能力。13進一步加強液相色譜質譜聯用儀的操作和數據處1.3理。2試劑或材料除非另有說明，僅使用分析純試劑，水為GB/T66821.2利用前2節課所學內容實際處理樣品，增強學生實踐能力。13進一步加強液相色譜質譜聯用儀的操作和數據處1.3理。2試劑或材料除非另有說明，僅使用分析純試劑，水為GB/T6682規定的二級水。2.12.2乙腈(C2H3N)：色譜純。氯化鈉(NaCl)：140℃干燥4h。2.3氨基固相萃取小柱：500mg/6mL(或性能相當的其它固相萃取柱)。2.4二氯甲烷-甲醇混合液：二氯甲烷+甲醇(體積比)=95+5。12

2.5標準品：見表1。2.6農藥標準溶液配制2.5標準品：見表1。2.6農藥標準溶液配制2.6.1標準儲備溶液分別準確稱取一定量（精確至0.1mg）農藥標準品，用甲醇溶解，逐一配成1000mg/L的單一農藥標準儲備液，密封貯存在-18℃冰箱中，使用期為6個月。農藥名稱純度（％）靈多菌>98琳吡蟲>98脒啶蟲>98磷辛硫>98菌素阿維>98威克百>989種農藥標準品表113

嘧霉胺〉982.6.2混合農藥標準溶液2.6.2混合農藥標準溶液分別準確吸取一定體積的9種農藥標準儲備溶液(4.8.1)注入同一容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度配制成100mg/L的混合標準儲備液，-18℃冰箱中密封閉光保存，使用期為3個月。2.6.3混合標準工作液2.6.3混合標準工作液吸取一定體積的混合農藥標準儲備液，用甲醇配制成0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L的7種農藥混合標準工作液，貯于4℃以下冰箱中，需現用現配。3儀器設備33.1電子天平：感量0.01g；3.23.33.43.5破壁食物料理機：不低于20000r/min3.1電子天平：感量0.01g；3.23.33.43.5破壁食物料理機：不低于20000r/min；均質機：不低于20000r/min；恒溫水浴鍋；旋轉蒸發儀；3.6氮吹儀。144試驗步驟41樣品制備.4.1.1鮮人參取不少于500g水果于破壁食物料理機中，以不低于20000r/min的轉速將樣品制成糊漿狀，充分混勻后裝入樣品密封盒中直接測定或-18℃存，備用。42樣品預處理4.2.1提取4.2.1提取稱取25稱取25g水果樣品（水果品種當季待定）,精50確至0.01g，于100mL具塞離心管中，加入mL乙腈，于勻質機中高速勻質1min，過濾至裝有7g氯化鈉的比色管中，振蕩200下，靜止分層，吸取10mL上層有機相于50mL濃縮管中，60c水浴中氮氣吹至近千，用2mL二氯甲烷一甲醇混合液溶解殘渣，待凈化。4.2.2凈化氨基柱用5mL二氯甲烷一甲醇混合液溶解進行預處理，當溶劑液面達上層篩板表面時，再倒入上述濃縮管中待凈化溶液，用濃縮瓶接收，待液面下降15

至上層篩板表面，用8mL二氯甲烷一甲醇混合液溶解分2次沖洗濃縮管并洗脫小柱,將濃縮瓶中洗脫液于40℃水浴中旋轉濃縮至盡干，氮氣吹干后用2.5mL甲醇和2.5mL水定容，過0.22pm濾膜待測。4.3儀器參考條件4.3.1液相色譜串聯質譜聯用儀：Qtrap4500三重四級4.3.1桿/離子阱質譜儀(配島津30A超高效液相色譜儀),電噴霧離子源，美國ABSCIEX公司。432色譜柱：KinetexXB-C18，2.1mmx150mmx2.6pm4.3.3流動相及流速見表14.3.44.3.3流動相及流速見表14.3.4色譜柱箱溫度：40℃進樣體積：進樣體積：5.0比步驟總時間/min流速/(l/min)0.1%甲酸銨水溶液/(%)甲醇/(%)10.0400901026400208036.140059