原位PCR技術在獸醫中的應用生物技術在獸醫方面的應用ContentsPCR的基本原理1PCR反應五要素2PCR的步驟3PCR反應特點

4PCR技術研究新進展5PCR儀器的發展

6在獸醫分子生物技術中的應用71.1PCR的基本原理聚合酶鏈反應或多聚酶鏈反應（PolymeraseChainReaction,PCR），又稱無細胞克隆技術(“freebacteria”cloningtechnique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

2、PCR反應五要素引物酶dNTP模板緩沖液即PCR反應的五要素3.PCR的步驟1DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2退火（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。3延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

4、PCR反應特點PCR反應特點特異性強

對標本的純度要求低

靈敏度高

簡便、快速

4.1特異性強

PCR反應的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結合；②堿基配對原則；③TaqDNA聚合酶合成反應的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。4.2靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。4.3簡便、快速PCR反應用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。5、PCR技術研究新進展簡并PCR的原理基本原理就是根據氨基酸序列設計兩組帶有一定簡并性的引物庫，從不同生物物種中擴增出未知核昔酸序列的基因。簡并PCR簡并PCR的應用找到進行PCR的基因序列，就會發現新基因。基因表達的檢測、病毒的檢測、基因組研究等。6、PCR儀器的發展pcr溫度循環至關重要，pcr擴增儀各參數必須準確。自perkin–elmercetus公司第一臺pcr擴增儀問世以來，現已有幾十家不同的廠家在國內外生產和銷售pcr擴增儀。在短短的幾年間，擴增儀經過幾代的發展，不斷采用新技術，并且進一步朝方便、實用、高智能化和自動化的方向發展。國內外生產的幾種DNA擴增儀儀器型號生產廠家型式特點管數報價1109型北京新技術所與軍科院聯合機械臂變溫水浴電子調溫40×0.5ml16400元/臺90A/B型中科院遺傳所機械臂變溫水浴電熱14000元/臺PTC-51A/B型軍事醫學科學院變溫氣流電子調兼作套式30×0.5ml12000元/臺DNAThermalCyclerPerkin–ElmerCetus(美)變溫鋁塊壓縮機致冷48×0.5mlUS$20000.-Thermocycler＃60＃00＃180B..Braun

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DM30000.-7.1檢測病原體與原位雜交相比,原位pcr先對待檢測片斷進行擴增,因而具有高度的敏感性,可檢出原位雜交檢不出的單拷貝、低拷貝（<20）基因。現已被用于多種病原體，病毒如FMDV、IBDV等,細菌如結核桿菌等,最近用原位PCR檢測組織中寄生感染的文獻也有報道大大提高了這些病原體的檢出率.7.2觀察病原體在體內的分布規律原位PCR能在感染組織的細胞內顯示特定病毒的DNA或RNA序列,為病毒的組織細胞定位;能將擴增結果和細胞類型聯系,確定受感染細胞的類型,探明病原的分布規律;還能動態觀察具有感染性的細胞數量百分比,以此判斷病情,評價藥效

7.3檢測導入基因原位PCR可用基因檢測的手段對外來基因進行鑒定,并判斷基因導入新環境后發生哪些變化,為臨床獸醫分子水平的研究和診斷提供有益的幫助,現已應用于基因治療和轉基因動物等導入基因的檢測和觀察.參考文獻PCR技術詳解及分析鄧小紅任海芳重慶工商大