免疫組化結果的分析和判斷一、免疫組化結果的判斷原則

⒈必須同時設對照染色。沒有對照染色的免疫組化染色結果是不可信的。

⒉抗原表達必須在特定部位。如LCA應定位在細胞膜上；CK應定位在細胞漿內；PCNA及p53蛋白應定位在細胞核內；EMA應定位在細胞膜上，等等。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。

⒊陰性結果不能視為抗原不表達。由于檢測方法靈敏度有高低之分，有時可因染色方法靈敏度不夠，而導致陰性反應，判斷時應注意。

⒌對免疫組化標記結果的意義不能絕對化，應結合臨床資料、X線等影像學及實驗結果綜合分析。二、對照染色設計

(一）對照染色的目的---排除假陰性和假陽性。假陰性的原因主要有三：①組織處理不當，抗原丟失過多或被遮蔽②抗體失活、效價過低或稀釋度不合適（主要指一抗，即特異性抗體）③染色步驟遺漏及差錯，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強度不當等。

假陽性系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有：①自發熒光或內源酶等干擾②抗體試劑不純(特別是一抗）③操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不當等④Fc受體的干擾，等等⒈陽性組織對照

用已證實含有靶抗原的同源及不同源組織切片或細胞涂片與待檢實驗切片同時作同樣處理和免疫染色的組織對照。正確的結果應呈現陽性目的：證實所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。⒉陰性組織對照用已證實不含靶抗原的同步處理和免疫標記染色的組織對照。正確的結果應為陰性目的：排除假陽性的可能。⑴空白對照

以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（主要的，必要時還可做第二抗體及橋聯抗體的空白取代），其他各步不變的試劑對照染色，結果應為陰性。⑵取代對照指以所用方法第一抗體同源動物的正常血清，或與本實驗無關的抗體(靶生物缺如的)取代第一抗體，其他步驟不變的試劑對照染色，結果應為陰性。⑶吸收試驗是指用事先經過量抗原吸收的第一抗體上清液取代第一抗體，其他步驟不變的免疫染色試劑對照。結果應是陰性或陽性著色明顯減弱（吸收不全時）。⑷抑制試驗

是指用標記抗體和未標記抗體（可以是一抗，也可以是二抗或橋抗體）兩者的混合物作試劑，其他步驟不變的免疫組化染色試劑對照，結果其陽性著色應成比例的減弱（等量或1：9）。此試劑對照多用于直接法。⒋自身對照是指在同一標記切片上的自身組織成分的陰性背景對照。即與靶抗原陽性反應細胞或成分相鄰的陰性背景結構的顯色，結果應為陰性或著色較淺，需與陽性著色成分呈鮮明對比目的：排除內源性干擾產生的假陽性和因抗原彌散移位造成的錯誤結果。三、非特異染色

非特異染色是指免疫組化染色過程中產生的非靶抗原的呈色結果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴重干擾免疫組化染色結果的正確判斷，應竭力避免或減輕。糾正的方法視原因而異，可在預實驗基礎上，采用有針對性的糾正對策，對癥下藥。四、陽性標記的形態特征和判斷免疫組化標記具有一定形態特點，若能熟練掌握則有助于對免疫組化標記結果的正確判斷。內容包括定性、定位和定量三方面。（一）陽性標記免疫特征：分"弱(+)、中(++)、強(+++)"三級。免疫熒光法（FITC為例）則表現為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光；免疫酶標記（HRP-DAB/H2O2）則表現為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。圖像攝影，原則上多取強陽性區域。（四）陽性標記強度特征依照細胞陽性著色程度（抗原含量），可分為弱陽性（+）┅1分；中等陽性（++）┅2分；強陽性（+++）┅3分。依照陽性細胞數量，可分為：弱陽性（+，指陽性細胞數在25%以下）┅1分；中等陽性（++,指陽性細胞數在25%—49%)┅2分；強陽性（+++，指陽性細胞數在50%以上)┅3分。目前多采用積分綜合計量。計算公式：兩者相乘（或相加）。大多主張<3者為陰性，>4者為陽性，>6者為強陽性，至少隨機觀察5-10個HPF,取其均值。五、染色失敗的可能原因

免疫組化染色的基本要求：①實驗切片的陽性抗原定位準確，呈色鮮明，背景著色淺或無②對照染色的結果應附合要求。否則，所得實驗結果都是錯誤的，或為假陽性或為假陰性。實驗切片呈陽性，陰性組織對照或陰性試劑對照也呈陽性原因：內源性干擾，試劑不純，交叉反應等假陽性實驗切片呈陰性，陽性組織對照及陰性試劑對照也均呈陰性的結果原因：組織處理不當，組織細胞抗原丟失或試劑錯誤(如漏加、錯加、失效、變質等),操作失誤等假陰性對照結果判斷：表中1～5結果無效，6、7結果可靠（＋）（＋）（＋）（－）（＋）（＋）（－）檢測標本含抗體，結果可靠（＋）（－）（－）7檢測標本不含抗體結合可靠（－）（－）（－）6非特異染色（＋）（＋）（－）5陽性對照不含定位抗原（＋）（－）（－）4陰性對照內含定位抗原(＋)(－)（－）（＋）3非特異性染色（＋）（＋）（＋）2抗體失活，操作有誤（－）（－）（－）1結果判斷檢測結果替代對照陰性對照陽性對照假陰性常見原因：抗原丟失或減弱