大豆蛋白的提取與含量測定

指導老師趙建軍曲寧夏婷孟繁新

蛋白質性質與應用技術關系圖蛋白質酸堿酶極性電荷離子交換層析電泳形狀分子量離心凝膠層析肽氨基酸疏水性親水性紙層析

一、大豆蛋白的提取

目的要求1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法2、計算粗提產率2、學習計算蛋白質收率實驗原理

大豆中含有豐富的蛋白質、根據提取方法及其其性質的不同，可以分為水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白、堿溶蛋白。將豆粉依次用上述溶劑提取，并用有機溶劑沉淀，可制得各部分蛋白質的干粉。本實驗主要是水溶提取大豆蛋白。稱出提出蛋白質的重量，已知原料重量，可以求出蛋白質的收率。

操作方法

1、水抽提將豆粉5g用約50毫升左右的蒸餾水少量多次的添加攪拌，常溫下攪拌抽提15min，3800r/min離心15min，取上清液，如上清液不清澈再經過濾。取上清液1毫升稀釋100倍留做蛋白測定。其余上清液加入等體積在冰箱中預冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（攪拌），用6mol/L和1mol/L

HCL，調PH4.5~5.0，3800r/min，離心15min，收集沉淀物，反復用丙酮攪拌洗滌離心2次，放入表面皿上，60度烘干，得到粉末狀蛋白質干粉，稱重，計算粗產率。

蛋白質產物重量蛋白質產率=×100%

原料總重量Folin酚法測定蛋白質濃度見第二實驗部分二、Folin酚法測定蛋白質含量

目的要求掌握Folin酚法測定蛋白濃度的原理和方法

實驗原理蛋白質濃度可以從它們的物理化學性質，如比重、紫外吸收，折射率等測定而得知；或用化學方法，如定氮、雙縮脲反應，Folin酚試劑反應等方法來計算。其中雙縮脲法和Folin酚法是一般實驗室中常用的方法，它們操作簡便，迅速，不需要復雜而昂貴的儀器。Folin酚法靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍。Folin酚法所用試劑是由兩部分組成，試劑甲相當于雙縮脲試劑，可與蛋白質中的肽鏈起顯色反應。試劑乙中的磷鉬酸和磷鎢酸在堿性條件下不穩定，易被酚類還原而呈蘭色（鉬蘭和鎢蘭混合物）。

試劑和器材

1、材料：本實驗所提取大豆蛋白水提取液，經合適稀釋至可測定范圍。2、試劑：（1）0.03mol/LPH7.8的磷酸緩沖液。（2）200μg/ml的標準酪（牛血清）蛋白溶液。（3）Folin試劑甲：（俗稱堿性銅試劑）：10gNaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3；稱取0.5g酒石酸鉀鈉溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上兩溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一個月。4、Folin試劑乙：在2升磨口回流裝置的燒瓶內，加鎢酸鈉（NaWO4·2H2O）100g，鉬酸鈉（NaMoO·2M2O）25g，蒸餾水700ml，85%的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，充分混合后，小火回流10小時，再加硫酸鋰（Li2SO4）150g，蒸餾水50ml及數滴溴。然后開口沸騰15min，以驅除過量的溴，冷卻后定容到1000ml，過濾后呈金黃色，于棕色瓶中保存，可使用多年。上述制備的Folin試劑乙的貯備液濃度一般在2mol/L左右，幾種操作方案都是把Folin試劑乙稀釋至1mol/L的濃度作為應用液，我們是把貯備液于作用前稀釋18倍，使之濃度為0.1mol/L略高。這種稀釋18倍后的Folin試劑乙就是下文稱之為應用液，Folin試劑乙貯備液濃度的標定，一般是以酚酞為指示劑，用Folin試劑乙去滴定1mol/L左右的標準NaOH溶液，當溶液顏色由紅變為紫灰色，再突然變成黑綠既為終點。如果用NaOH去滴定Folin乙，終點不太好掌握，溶液的顏色是由淺黃色變為淺綠色，再變為灰紫色為終點。3、器材：

試管10支試管架一個移液管：（5ml、1ml）移液管架洗瓶恒溫水浴723型分光光度計2、樣品測定：取三支試管（平行）各加入待測的蛋白質樣品液1ml和空白，如下操作：試管號空白12蛋白質稀釋液（ml）

（mg)011PH7.8的buffer（ml）

100Folin-甲試劑

（ml）

111于室溫下不停地振蕩10minFolin-乙應用液（ml）444立即搖勻，在55℃恒溫水浴中保溫5min，用流水冷卻1min后，測A650A650值3.蛋白質濃度的計算：

A650值對應的mg數(Pr)Pr(mg/ml)=×稀釋倍數