第三章放射性示蹤的標記技術第1頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一第一節

放射性標記的基本知識

天然放射性核素，半衰期比較長，比活度較低，分布分散而且品種有限。人工放射性核素，可用核反應堆、加速器和核素發生器生產，其原始狀態通常都是無機鹽類。例如Ba14CO3，NaH232PO4，45CaCl2，59FeCl314C、3H、32P、35S和125I等作示蹤原子，并且要把它們做成與體內物質相應的有機化合物而開展示蹤研究。第2頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的概念凡是分子中某一原子或某些原子（或基團）被放射性核素或穩定核素所取代，而成為一類易被識別的化合物，則稱之為標記化合物。第3頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的分類1．同位素標記化合物（isotopiclabeledcompound）化合物中某元素的穩定同位素原子被同一元素的放射性同位素或穩定同位素原子取代，取代前后的化合物在理化性質上完全相同（同位素效應除外），這類標記稱為同位素標記（isotopiclabeling）。2．非同位素標記化合物（nonisotopiclabeledcompound）該類標記化合物是用化學性質相似或根本不同的放射性核素取代原化合物中所含的某元素的穩定核素原子。這種標記稱非同位素標記（nonisotopiclabeling）。第4頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的命名有機標記化合物的命名，通常先指出標記位置，再列出標記核素，最后是化合物的名稱，如l-14C-醋酸。無機標記化合物命名，通常在化合物的前面注明放射性核素，也可把標記核素直接寫在分子式內，如125I-碘化鈉（125I-NaI）或Na125I。第5頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的分型l.定位標記S（specificlabeling）它是指放射性核素只局限于標記化合物分子中某一特定的位置上，而在其他位置上的同種原子就不具有放射性。常用“S”表示，如1-14C（S）-乙酸或1-14C-乙酸，表示第1位碳原子被放射性14C標記。2.準定位標記n（nominallabeling）在3H標記中，理論上應獲得預期的定位標記分子，實際上，3H在預期位置上的分布，有時低于化合物中3H總量的95％，或百分比值不詳。此類標記稱準定位標記，用“n”表示。這是一種名義上的定位標記，因此，也稱名義定位標記。第6頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的分型3.均勻標記U（uniformlabeling）是一種非定位標記（non-specificlabeling），常用于14C標記的化合物中。它是指整個分子中某元素所有的原子均可能被放射性同位素取代，取代的幾率是相等的，而且放射性原子在分子中的分布是均勻的，達到統計學上的均一性。4.全標記G（generallabeling）它是指化合物中某種原子不管在什么位置上都可能是帶放射性的。全標記主要用于3H標記的化合物，在化合物分子中，任何有氫元素的位置上，都可能被氚所取代。但是由于各個氫原子在分子中的位置不同，在標記制備過程中被氚取代的幾率不同，不具有統計學上的均一性，因而全標記的化合物往往是全而不均的。第7頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的分型5.雙標記或多標記（doublelabelingormultiplelabeling）在生物學示蹤實驗中，有時需要在化合物分子中引入兩種或兩種以上元素的同位素，或引入一種元素的兩種或兩種以上的同位素原子，這種標記化合物稱為雙標記或多標記化合物。例如15NH214CH２COOH（氨基乙酸）第8頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一第二節

放射性標記的基本方法

1．標記核素的選擇（1）合適的核性質：γ射線；半衰期；比活度；（2）得到的產物與被示蹤化合物性質應盡量接近；（3）標記方便，標記的化合物穩定第9頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一放射性核素標記的基本方法2．核素標記的要求：（1）放射性核素標記率應盡量高，未標記的核素應注意回收利用。（2）放射性核素標記需用微量或超微量方法進行標記、純化和鑒定。（3）盡量減少放射性核素的稀釋，避免加入不必要的載體；（4）最好用同位素標記。如使用非同位素標記，則標記位置應以不影響標記分子的特定功能為佳；（5）標記過程應簡單、快速。最好在標記的最后階段加入核素，以減少損失和污染；有條件時，在標記前作冷實驗，以取得經驗。第10頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一放射性標記基本方法

1．化學合成標記法（chemicalsynthesis）此方法是通過化學反應將放射性核素引入化合物中。換言之，就是將放射性核素的初始原料，通過選定的工藝步驟，合成所需要的標記化合物。此法不僅比活度高，而且能夠定位標記，但合成步驟較多。14C、3H和放射性碘標記化合物常用此法進行合成標記。這類標記化合物已廣泛用于藥理、代謝和分子的化學結構等方面的研究。對于需要制備的標記化合物來說，當然是已知結構的物質。第11頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一化學合成標記法

（chemicalsynthesis）注意以下幾個問題：（1）必須注意操作量與比活度的關系對生物學示蹤實驗來說，使用的標記化合物的量愈少，愈接近于生物體的正常生理狀態。但另一方面，示蹤物質進入生物體以后，要受到大量正常物質的稀釋，需要使用的標記化合物的比活度愈高愈好。第12頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一1.化學合成標記法（2）必須有較高的反應產物。因為有機反應常常伴隨許多副反應產物。較高的反應產物一方面使原料的利用率高，更主要的是減少了樣品中的放射性雜質。（3）標記化合物必須在完全密封的系統內有機合成因為所有的標記化合物的合成都要從簡單的放射性無機鹽類開始，大部分中間產物都是低分子量的放射性氣體或者揮發性液體，為了安全防護和防止物料損失，一般反應要在“真空線中”進行。第13頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一2．同位素交換標記法

（isotopeexchange）同位素交換標記法是利用同一元素的放射性核素與化合物中的非放射性核素之間的交換反應來制備所需要的標記化合物。該方法操作快速、簡便。在放射性核素半衰期短、化學合成步驟多的情況下，該方法的實用意義更大。適用于大量有機化合物、天然產物或難以制得前體的標記化合物的制備，是制備3H標記化合物的重要方法。同位素交換法包括酶促合成法、催化交換法和氣體曝射法。第14頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一2．同位素交換標記法

（isotopeexchange）（1）酶促合成法在酶的催化下，可以合成某些特殊的標記化合物，例如γ-32P-ATP的合成常用此法。反應機理是利用非放射性的腺苷三磷酸在3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的催化下，使腺苷三磷酸γ位上的磷酸與磷-32標記的無機磷酸鹽之間進行同位素交換反應。第15頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一2．同位素交換標記法

（isotopeexchange）（2）催化交換法常用于氚標記化合物的制備。將欲標記的有機化合物和催化劑（常用PdO-BaSO4或者Pd-C）置于溶劑中，通入氚氣，室溫攪拌數小時后竟分離純化后即可得氚標記的化合物。此法可制備氚標記的氨基酸、嘌呤類核苷和核苷酸、激素等。液相的催化交換法是將待標記物溶解在氚水（3H2O）中，用鈀、鉑作催化劑，在一定pH值和溫度下，置特定的真空系統里進行氫和氚的交換反應。第16頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一2．同位素交換標記法

（isotopeexchange）（3）氣體曝射法將需要標記的有機化合物置于比活度很高的氚氣中，密封放置幾天至幾星期，使氚氣中的氚與有機化合物中的氫原子發生交換反應而制得氚標記化合物。可用高頻放電、微波、紫外線、γ射線照射等促使氚氣電離，或者在反應中加貴金屬作催化劑，使交換標記過程加速。第17頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一3．生物合成標記法（biosynthesis）該方法是利用酶、微生物、動植物的生理代謝過程，引入放射性核素合成有機化合物。特別是對目前尚不能用人工方法合成的有機化合物，如某些激素、蛋白質、抗生素、核酸、維生素等，可用生物合成法制備。生物合成法比化學合成法容易，能夠從自然界直接獲得有生物活性的異構體。生物合成的缺點是產額低，標記位置不易控制，易造成類似標記物，增加了標記的分離和提純的難度。生物合成法可分為兩類：全生物合成法和酶促合成法（enzymaticsynthesismethod）。第18頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一3．生物合成標記法（biosynthesis）（1）全生物合成法

它是利用完整的生物或其某一個器官的生理代謝過程來進行標記。如生物合成氨基酸、糖和核酸均為全生物合成。常用的生物有細菌、藻類、酵母等低等生物，它們容易在實驗室中培育，代謝旺盛，繁殖迅速，因而制備效率高。第19頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一3．生物合成標記法（biosynthesis）（2）酶促合成法

它是利用生物組織中某種特定的酶，促進標記前體物質的合成反應，生成所需的標記產物。在酶的催化下，可將放射性核素結合到生物分子上。該方法合成的標記化合物很多是具有旋光性的異構體，產物不必經過分離。因此，酶促合成法也可看作是應用特殊催化劑的化學合成法。例如，應用3H、32P、35S等核素標記的核苷酸類就屬于酶促合成法。第20頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一常用標記化合物及其制備1．放射性碳的標記化合物生物醫學中用得最多的是14C和11C。14C半衰期為5730年,半衰期長，能保證連續實驗，又不需要進行放射性衰變校正。只發射β-粒子（0.159MeV），用液閃測量很方便；外照射較弱，易防護；用于自顯影時，影像清晰；14C標記化合物的放射性比活度可高達2308.8MBq／毫克原子，豐度可達100％（商品達80％以上）；14C可定位標記，純化方便。與3H相比，14C標記化合物輻射自分解速度低；由于構成物質的C－C鍵比較牢固，標記化合物中的14C原子也比較穩定。第21頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一1．放射性碳的標記化合物由反應堆生產的14C為Ba14CO3，放射性碳的標記常從最簡單的化合物（如11CO2或Ba14CO3）為原料，先制備出一批基本的“鑰匙”化合物，然后逐步合成得到更復雜的所需的產品。14C標記化合物制備工藝復雜，要求設備條件高和防護措施全。一般放射性實驗室從事14C標記有一定的困難。14C標記化合物的制備方法，基本上分為化學合成法、生物合成法和輻射合成法三類。第22頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一（1）14C標記化合物的有機合成以Ba14CO3為起始物制備14C的標記化合物可通過以下三條途徑：①通過14CO2合成②通過14C–氰化鈉（Na14CN）合成③通過14CH≡14CH合成第23頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一（2）14C標記化合物的生物合成將某一植物放在充滿14CO2的密閉室里，用強光照射時，葉子進行光合作用。幾個小時以后，葉子中已合成了標記的葡萄糖、淀粉和其他化學成分。如果植物的量足夠多，根據需要可進行分離提取，有些標記的藥物就是這樣制備出來的。用這種生物合成的方法，可以準確地制備某種具有生理活性的旋光異構體。第24頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一2．3H標記化合物在生物學示蹤實驗中，氚的重要性僅次于14C。氚標記化合物有許多突出的特點：（1）氚的半衰期為12.35a，故有充裕的時間制備標記化合物和從事示蹤研究。（2）氚的比活度高，可達1077.44GBq／毫克分子，比較容易獲得高比活度的標記化合物。并可借助核磁共振儀鑒定3H在標記物中的標記結構。（3）氚為弱β-輻射體（Emax=18.4keV），射線能量低，射程短，操作時易于防護，在放射自顯影中具有很好的分辨率。（4）氚的豐度高，標記化合物的制備方法較14C容易。一些難以用14C標記的化合物，如肽類、蛋白質等，常可用3H標記。此外，還能作為碳骨架結構的示蹤劑，這點是14C所不及的。第25頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一2．3H標記化合物氚標記化合物的缺點是碳-氚鍵的結合不夠牢固，有時會發生丟失；分子中氚標記的位置不易準確估計；氚標記的化合物比相同比活度的14C標記的化合物因受輻射而分解的程度嚴重的多。氚標記的化合物的用途較廣，用化學合成法、同位素交換法和生物合成法均可制備。第26頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一（1）氚標記化合物的有機合成法氚標記的原始原料是氚氣和氚水。①以氚氣（T2）為原料，通常對氚的豐度和比活度要求很高，一般有催化法、氚鹵置換和還原法三種。氚特別適于標記比較復雜的化合物，例如酶、蛋白質和藥物等。將待標記化合物研成粉末，放在管子里，通入高活性的氚氣。當氚氣與有機化合物密切接觸時，大量的β射線足以使C-H鍵斷裂，形成不穩定的中間產物，可以與氚結合形成新的C-T鍵，于是經過取代反應氚就進入待標記化合物的分子中。②以氚水（T2O）為原料。第27頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一（2）氚標記化合物的生物合成法利用細胞離體培養法可以制備比活度較高的標記核酸。分子生物學的核酸標記方法，是利用酶促反應將3H標記的NTP或dNTP通過DNA合成反應參入到核酸分子的內部，或通過酶促將其連接到核酸分子兩端。第28頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一3.碘標記化合物化學合成法:一般先將放射性碘離子氧化成分子碘（2Na*I+H2O2→2NaOH+*I2）或者一氯化碘，然后利用有機化合物很易發生碘代反應的特點，制備碘標記的化合物。氧化反應通常使用的氧化劑有H2O2

，ICl和氯胺-T等。第29頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一第三節

蛋白質和多肽的放射性碘標記

原理:

大多數有機化合物分子中并沒有碘原子，但由于碘原子具有高度的化學活性，所以放射性碘很容易通過置換法取代肽鏈上酪氨酸苯環的氫原子而得到碘標記的化合物。碘標記率與被標記的蛋白質、多肽類激素分子中酪氨酸的含量及暴露程度有關。放射性碘有131I、125I、123I、124I等，其中125I和131I是生物醫學中最常用的放射性核素。第30頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一碘標記化合物的優點放射性比活度高，可提高分析的靈敏度；它們的半衰期不短也不長，很適于生物樣品的測量；特別是125I能放出均勻的γ射線，便于體外進行γ計數測量，易于推廣。放射免疫測定法多半使用碘標記的化合物，可用碘-125放免儀進行測量。123I和124I標記化合物主要用于核醫學臨床功能檢查，131I用于甲狀腺疾病和各種腫瘤的治療，125I標記化合物則主要用于生物醫學研究與體外示蹤分析。第31頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一放射性碘的標記方法1.氯胺-T（Ch-T）法氯胺-T是一種較溫和的氧化劑，在水溶液中形成次氯酸，能連續不斷地將溶液中的碘離子I-氧化為分子態的碘*I2或*I+，在pH為7.5的環境里能與蛋白質的酪氨酸殘基上羥基鄰位的氫原子發生置換反應，制得碘標記物。第32頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一放射性碘的標記方法2.乳過氧化物酶法

用乳過氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）催化過氧化氫（H2O2

）釋放出活潑的新生態氧，使125I離子活化并標記在蛋白質酪氨酸殘基上的一種標記方法。以標記蛋白質為例，LPO與H2O2首先形成絡合物，將放射性碘負離子氧化成碘分子，在LPO的催化下，將蛋白質碘化。此類酶催化反應速度很快，標記物比活度高，又保持其生物活性和免疫活性。特別適用于一些容易失活的多肽類的標記，如血纖維蛋白原、胰島素、嘧啶、核苷和組氨酸等小分子化合物。第33頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一放射性碘的標記方法3.固相氧化劑法包括Iodogen標記法和IodoBeads標記法兩種。Iodogen（1，3，4，6-tetrachloro-3α-6α-diphenlglycoluril,氯甘脲）不溶于水，能溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜等有機溶劑。Iodogen在碘標記過程中起催化作用，使用時毋須新鮮配制，催化反應終止時不需加還原劑。Iodogen和Ch-T同屬于氯酰胺碘化反應類型，是一種不溶于水的固相氧化劑，能將放射性碘負離子氧化成碘分子，從而與蛋白質或多肽分子中酪氨酸殘基上羥基鄰位的氫原子發生置換反應。該法已用于單克隆抗體、多肽、生物膜和活細胞的碘標記。第34頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一放射性碘的標記方法3.固相氧化劑法Iodogen標記法不與蛋白質密切接觸，反應過程中的氧化損傷小，反應時間易控制，碘利用率高于Ch-T法，利用Iodogen不溶于水的特點，可直接對培養細胞進行碘標記，方法簡便。第35頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一放射性碘的標記方法4.聯接標記法（conjugationallabeling）這是一種間接標記方法。先使放射性碘與聯接劑相結合，然后碘標記的聯接劑再結合到蛋白質或多肽分子上，成為標記化合物。最常用的聯接劑是3-（對-羥基苯）丙酸-N琥珀亞胺酯酰化劑（HPNS，即Bolton－Hunter試劑）。基本原理是：在Ch-T作用下，先用Na125I使酰化劑HPNS碘化。然后在弱堿性條件下，125I-HPNS通過一個酰氨鍵與蛋白質N末端的氨基聯結，制得蛋白質標記物。此法適用于缺乏酪氨酸的蛋白質如卵清蛋白、肌紅蛋白的標記。第36頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一第四節

核苷和核苷酸的放射性標記

一、32P-核苷酸標記技術磷和硫是核酸和蛋白質本身所含有的元素。32P標記的核苷酸類是基因工程研究中不可缺少的標記化合物，如用于DNA序列測定；35S-胱氨酸和35S-蛋氨酸用于研究蛋白質代謝過程，它們均為生物醫學中不可缺少的試劑。32P及35S均發射β-射線，32P（T1/2=14.3d，Emax=1.71MeV）和35S(T1/2=87d，Emax=0.167MeV)標記物的制備主要有化學合成、生物合成、酶促法和同位素交換法等。兩種核素比較，35S能量低，不需特殊防護，電泳自顯影條帶清晰，分辨率高。而32P則因射線能量較高，實驗中應加必要的防護第37頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一一、32P-核苷酸標記技術γ-32P-ATP（32P-三磷酸腺苷）和α-32P-dATP的標記通常用酶促法。方法見書.第38頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一二、[甲基-3H]-TdR標記技術胸腺嘧啶核苷的氚標記通常用生物合成法得到,即以[甲基-3H]-胸腺嘧啶作為前體，在脫氧核糖轉移酶的催化作用下，生成[甲基-3H]-胸腺嘧啶核苷。氚標記的胸腺嘧啶核苷（tritiatedthymidine，3H-TdR）可有效結合到DNA中，因此在體外細胞培養中可使細胞被標記，主要用于淋巴細胞的免疫功能測定、細胞轉化、分裂、和增殖以及分子遺傳等研究。第39頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一三、5-125I-2′-脫氧尿嘧啶核苷

（125I-UdR）標記技術方法見書。

四、核酸的體外碘標記標記原理：加熱把DNA解析成單鏈，在三氯化鉈（TlCl3）氧化作用下，使125I原子與胞嘧啶環上5位碳原子以穩定的共價鍵相結合，而形成5-碘胞嘧啶。第40頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一第五節

放射性標記化合物的質量控制

1.檢驗合成的標記化合物是否與原來設計的化合物相符，特別是標記原子是否在預定的位置上；2.檢驗標記化合物中是否有雜質以及雜質含量有多少。第41頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的純化各種方法得到的標記化合物都含有一定量的雜質，放存一段時間的標記化合物也會出現分解產物，所以在使用前必須分離純化。常用的純化方法：沉淀法、萃取法、離子交換分離法和層析分離法等。第42頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的質量鑒定

1．放射性核素純度（radionuclidepurity）

指標記化合物所需要放射性核素的活度占樣品中各種核素總放射性活度的百分比，計算公式如下：

一般要求標記化合物的放射性核素純度應在98％以上。常用檢查方法有兩種：（1）半衰期測定法，適用半衰期短的核素，一般跟蹤時間為3～5個半衰期；（2）射線能量測定法，利用各種放射性核素固有的能譜，測定放射性核素的純度。第43頁，共50頁，2023年，2月20日，星期一標記化合物的質量鑒定2．標記率（labelingefficiency）指所標記的物質（有可能包括一種以上的化學形態）放射性活度占樣品中總放射性活度的百分比。3.放射化學純度（radiochemicalpurity）指某一特定化學形態的標記物活度占總放射性活度的百分比。放射化學純度一