模板序列現(xiàn)在是1頁\一共有115頁\編輯于星期四現(xiàn)在是2頁\一共有115頁\編輯于星期四現(xiàn)在是3頁\一共有115頁\編輯于星期四第二章基因工程的酶學基礎Enzymes現(xiàn)在是4頁\一共有115頁\編輯于星期四現(xiàn)在是5頁\一共有115頁\編輯于星期四現(xiàn)在是6頁\一共有115頁\編輯于星期四(II類)限制性內切酶

限制性內切酶的存在給沒給基因工程操作帶來麻煩？限制性內切酶在基因工程操作中有哪些具體用途？現(xiàn)在是7頁\一共有115頁\編輯于星期四首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。(II類)限制性內切酶

分離的第一個酶是HindⅡ現(xiàn)在是8頁\一共有115頁\編輯于星期四一、限制性內切酶的基本特性

是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內切酶。（1）識別位點4—8bp，回文結構思考題1、在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一個6bp的II類限制性內切核酸酶的識別序列，該位點的序列可能是什么？2、下面幾種序列中你認為哪一個（哪些）最有可能是II類限制性內切核酸酶的識別序列：GAATCG,AAATTT,GATATC,ACGGCA?為什么？現(xiàn)在是9頁\一共有115頁\編輯于星期四（2）內切酶與識別序列的結合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結合。GAATTCCTTAAG現(xiàn)在是10頁\一共有115頁\編輯于星期四（3）切割位點EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產生？末端EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產生？末端切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識別位點處。現(xiàn)在是11頁\一共有115頁\編輯于星期四（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點）GAATTC

CTTAA

GG

AATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’現(xiàn)在是12頁\一共有115頁\編輯于星期四CTGCAG

②3’端凸出（如PstI切點）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

G

ACGTC現(xiàn)在是13頁\一共有115頁\編輯于星期四

①連接便利（5）粘性末端的意義只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。現(xiàn)在是14頁\一共有115頁\編輯于星期四現(xiàn)在是15頁\一共有115頁\編輯于星期四凸出的3’端可以通過末端轉移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標記，3’末端加尾凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。現(xiàn)在是16頁\一共有115頁\編輯于星期四識別位點的序列相同的限制性內切酶。（6）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’現(xiàn)在是17頁\一共有115頁\編輯于星期四XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：現(xiàn)在是18頁\一共有115頁\編輯于星期四識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（7）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。現(xiàn)在是19頁\一共有115頁\編輯于星期四5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A現(xiàn)在是20頁\一共有115頁\編輯于星期四二、DNA末端長度對限制酶切割的影響

限制酶切割DNA時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。現(xiàn)在是21頁\一共有115頁\編輯于星期四

在設計PCR引物時，如果要在末端引入一個酶切位點，為保證能夠順利切割擴增的PCR產物，應在設計的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長度對切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點時選擇酶切秩序。溫馨提示——Becareful現(xiàn)在是22頁\一共有115頁\編輯于星期四表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）限制酶

待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）限制酶

待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0限制酶待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表1：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）

現(xiàn)在是23頁\一共有115頁\編輯于星期四

某些限制酶對同一介質中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點偏愛。三、位點偏愛（Sitepreference）現(xiàn)在是24頁\一共有115頁\編輯于星期四

λ噬菌體DNA為48502bp，含12bp粘端。EcoRⅠ酶切割噬菌體中的5個位點時并不是隨機的，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快10倍；

某些噬菌體DNA中的某些相同的酶切位點對酶的敏感性是不同的。如：現(xiàn)在是25頁\一共有115頁\編輯于星期四四、在實驗室條件下進行酶切20微升反應體系現(xiàn)在是26頁\一共有115頁\編輯于星期四五、酶切反應條件終止酶切的方法緩沖液反應溫度反應時間現(xiàn)在是27頁\一共有115頁\編輯于星期四緩沖液(Buffer)（1）緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。現(xiàn)在是28頁\一共有115頁\編輯于星期四不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525溫度現(xiàn)在是29頁\一共有115頁\編輯于星期四

EcoRⅠ若反應16小時，所需酶量為正常酶切時間的1/8，即若反應時間為16小時，則所用酶量為只切1小時的1/8。

反應時間

反應時間通常為1小時或更多，許多酶延長反應時間可減少酶的用量。例如：現(xiàn)在是30頁\一共有115頁\編輯于星期四終止酶切的方法苯酚加熱EDTA現(xiàn)在是31頁\一共有115頁\編輯于星期四

EDTA可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應，終止?jié)舛葹?0mM；

加熱是常用的方法，對于最佳反應溫度為37℃的酶，在65℃或80℃處理20分鐘可使酶活性大部分喪失。

對于在80℃作用20分鐘也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用試劑盒純化DNA。現(xiàn)在是32頁\一共有115頁\編輯于星期四與酶切反應條件相關的兩個現(xiàn)象現(xiàn)在是33頁\一共有115頁\編輯于星期四

在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱。星號（*）活性。1、星號（*）活性現(xiàn)在是34頁\一共有115頁\編輯于星期四EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時候要特別注意！現(xiàn)在是35頁\一共有115頁\編輯于星期四內切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。2、完全消化與局部消化123412341）、完全消化現(xiàn)在是36頁\一共有115頁\編輯于星期四只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。2）、局部消化123414現(xiàn)在是37頁\一共有115頁\編輯于星期四

請確定XbaI,XhoI和KpnI位點在DNA上的相對位置。現(xiàn)在是38頁\一共有115頁\編輯于星期四現(xiàn)在是39頁\一共有115頁\編輯于星期四六、影響限制性內切酶活性的因素外因內因

外因是可預見和控制的，如反應條件、底物的純度（是否有雜質、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當、反應體積的選擇以及反應時間的長短等等

內因包括位點偏愛性、甲基化底物、底物的構象。構象的影響主要指切割線性DNA和超螺旋DNA時的活性，如與切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來切割pBR322的超螺旋DNA現(xiàn)在是40頁\一共有115頁\編輯于星期四從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復制一定有斷口。現(xiàn)在是41頁\一共有115頁\編輯于星期四（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNAligase的特點（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。現(xiàn)在是42頁\一共有115頁\編輯于星期四（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件現(xiàn)在是43頁\一共有115頁\編輯于星期四1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應的機理2.ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi現(xiàn)在是44頁\一共有115頁\編輯于星期四4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP現(xiàn)在是45頁\一共有115頁\編輯于星期四5.3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。現(xiàn)在是46頁\一共有115頁\編輯于星期四連接酶反應的最佳溫度是37C。四、連接反應的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結合很不穩(wěn)定。2.實用溫度所以一般采用4~16C。現(xiàn)在是47頁\一共有115頁\編輯于星期四增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.插入片段與載體的濃度比例2.反應溫度12.5℃。五、影響連接反應的因素10~20倍。一般14~16℃現(xiàn)在是48頁\一共有115頁\編輯于星期四第三節(jié)DNA聚合酶(自學)一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉錄酶現(xiàn)在是49頁\一共有115頁\編輯于星期四1.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。現(xiàn)在是50頁\一共有115頁\編輯于星期四DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較現(xiàn)在是51頁\一共有115頁\編輯于星期四三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質①一條單鏈多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。現(xiàn)在是52頁\一共有115頁\編輯于星期四①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應條件-OH5’3’dNTPs現(xiàn)在是53頁\一共有115頁\編輯于星期四標記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結合的，帶有標記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補的待測序列雜交現(xiàn)在是54頁\一共有115頁\編輯于星期四標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’3’現(xiàn)在是55頁\一共有115頁\編輯于星期四③DNA聚合酶I對探針序列的標記缺口轉移法(nicktranslation)：放射性同位素標記：DNA聚合酶I同時具備5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。現(xiàn)在是56頁\一共有115頁\編輯于星期四5’3’外切酶活性從DNA缺口的下一段DNA5’端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在缺口的上一段DNA的3’一側補上一個新的核苷酸。缺口缺口5’5’3’3’5’3’5’3’現(xiàn)在是57頁\一共有115頁\編輯于星期四純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進行缺口轉移一種-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記8現(xiàn)在是58頁\一共有115頁\編輯于星期四2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶現(xiàn)在是59頁\一共有115頁\編輯于星期四①3’端補平5’5’klenow②DNA3’末端標記補平限制性內切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途現(xiàn)在是60頁\一共有115頁\編輯于星期四3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根據(jù)末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標記的DNA限制性內切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h現(xiàn)在是61頁\一共有115頁\編輯于星期四③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物現(xiàn)在是62頁\一共有115頁\編輯于星期四（1）T4DNA聚合酶的性質3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性現(xiàn)在是63頁\一共有115頁\編輯于星期四③特點當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。現(xiàn)在是64頁\一共有115頁\編輯于星期四5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’現(xiàn)在是65頁\一共有115頁\編輯于星期四（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。①補平隱蔽末端②DNA3’末端標記現(xiàn)在是66頁\一共有115頁\編輯于星期四酶切中間產生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內切酶切無dNTPs現(xiàn)在是67頁\一共有115頁\編輯于星期四a.放射性標記的優(yōu)缺點：制作簡單、高比放射性、放射自顯影效果好。優(yōu)點：缺點：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對人體有害。要求在專門實驗室操作。現(xiàn)在是68頁\一共有115頁\編輯于星期四b.非放射性標記i）生物素標記：生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP酰化結合成為生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（biotinligase）催化與蛋白質共價結合。現(xiàn)在是69頁\一共有115頁\編輯于星期四純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進行缺口轉移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉移法將生物素摻入DNA探針中現(xiàn)在是70頁\一共有115頁\編輯于星期四光促生物素標記生物素連接臂光敏基因探針序列探針序列生物素連接臂光敏基因+光照現(xiàn)在是71頁\一共有115頁\編輯于星期四抗生物素蛋白（avidin）：鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的識別——親和素：是一種雞卵清蛋白。細菌中avidin的類似物。能與生物素特異結合的蛋白或抗體，常用：現(xiàn)在是72頁\一共有115頁\編輯于星期四ii）地高辛標記：可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入DNA合成過程。形成地高辛標記的DNA探針。生物素和地高辛標記的探針都有商品化的試劑盒(kit)。地高辛的結合物是抗地高辛抗體。現(xiàn)在是73頁\一共有115頁\編輯于星期四現(xiàn)在是74頁\一共有115頁\編輯于星期四iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反應，反應的過程中發(fā)出熒光（或生成有色的產物）。酶的作用：現(xiàn)在是75頁\一共有115頁\編輯于星期四化學發(fā)光底物現(xiàn)在是76頁\一共有115頁\編輯于星期四HRPO和AP的顯色反應底物現(xiàn)在是77頁\一共有115頁\編輯于星期四發(fā)光反應機理現(xiàn)在是78頁\一共有115頁\編輯于星期四iv）用非放射性標記的探針檢測原理生物素探針序列待測基因親和素酶底物中間產物產物發(fā)光探針DNA用生物素或地高辛標記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個發(fā)光或顯色反應。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結合。現(xiàn)在是79頁\一共有115頁\編輯于星期四核酸探針雜交篩選法的缺點是：只檢測是否有外源DNA插入，而不論該DNA是否表達出產物。現(xiàn)在是80頁\一共有115頁\編輯于星期四4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。現(xiàn)在是81頁\一共有115頁\編輯于星期四（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一旦與模板結合就會不間斷地合成互補鏈。②3’5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結構的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結構的阻礙現(xiàn)在是82頁\一共有115頁\編輯于星期四②進行末端標記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③補平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。現(xiàn)在是83頁\一共有115頁\編輯于星期四5.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學修飾去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測序雙脫氧法。②標記DNA3’隱蔽末端③更有效地補平末端現(xiàn)在是84頁\一共有115頁\編輯于星期四6.逆轉錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質由和兩條多肽鏈組成。現(xiàn)在是85頁\一共有115頁\編輯于星期四①鏈有反轉錄活性和RNaseH活性。RNaseH：鏈經過蛋白酶水解后產生的一條多肽。以5’3’或3’5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA現(xiàn)在是86頁\一共有115頁\編輯于星期四（3）逆轉錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA現(xiàn)在是87頁\一共有115頁\編輯于星期四②合成DNA探針用隨機引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機引物：隨機順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結合）③RT-PCR用的模板克隆某個基因時，用其mRNA反轉錄出cDNA第一鏈。現(xiàn)在是88頁\一共有115頁\編輯于星期四第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個亞基。3.特性（1）5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）現(xiàn)在是89頁\一共有115頁\編輯于星期四②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、是3’—OH突出的雙鏈DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④隨機添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端轉移酶現(xiàn)在是90頁\一共有115頁\編輯于星期四4.末端轉移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉移酶現(xiàn)在是91頁\一共有115頁\編輯于星期四（2）再生酶切位點便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補平現(xiàn)在是92頁\一共有115頁\編輯于星期四AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉移酶dTTPAAAAAA外源DNA現(xiàn)在是93頁\一共有115頁\編輯于星期四（3）非放射性標記DNA片斷的3’端AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點HindⅢ位點連接催化非放射性標記物參入DNA片斷的3’端。（生物素-11-dUTP等）現(xiàn)在是94頁\一共有115頁\編輯于星期四二、T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化磷酸從ATP轉給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。現(xiàn)在是95頁\一共有115頁\編輯于星期四5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸帶有32P標記，就會被轉移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。現(xiàn)在是96頁\一共有115頁\編輯于星期四3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷酸酶（1）正向反應（forwardreaction）現(xiàn)在是97頁\一共有115頁\編輯于星期四（2）交換反應標記法反應混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應效果不理想。現(xiàn)在是98頁\一共有115頁\編輯于星期四

三、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。現(xiàn)在是99頁\一共有115頁\編輯于星期四2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體份子自我連接現(xiàn)在是100頁\一共有115頁\編輯于星期四單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’現(xiàn)在是101頁\一共有115頁\編輯于星期四A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。現(xiàn)在是102頁\一共有115頁\編輯于星期四ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個nick，但轉入細菌后會被修復。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA9現(xiàn)在是103頁\一共有115頁\編輯于星期四第五節(jié)核酸外切酶（Exonucleases）是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。一、單鏈DNA外切酶1.大腸桿菌核酸外切酶I