第六章酶、細胞、原生質體的固定化一、固定化酶（ImmobilizedEnzyme）1.定義：固定化酶是指將水溶性的酶用物理或化學的方法處理，使之成為不溶于水的，但是仍具有生物活性的酶。催化反應后的酶可以回收重復使用。第一節酶的固定化固定化酶優點：極易將固定化酶與底物、產物分開，簡化了提純工藝；可以在較長時間內進行反復分批反應和連續反應，酶的使用效率提高，成本降低；在大多數情況下，能夠提高酶的穩定性；酶反應過程能夠加以嚴格控制；較游離酶更適合于多酶反應；可以增加產物的收率，提高產物的質量。。必須注意維持酶的催化活性及專一性應該有利于生產自動化、連續化應有最小的空間位阻酶與載體必須結合牢固，從而使固定化酶能回收貯存，利于反復使用固定化酶應有最大的穩定性，所選載體不與廢物，產物或反應液發生化學反應固定化酶成本要低，以利于工業使用二、固定化酶的制備原則酶的固定化：采用各種方法，將酶與水不溶性的載體結合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化方法有很多，但對任何酶都適用的方法是沒有的，必須經過試驗研究才能確定。酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、結合法、交聯法和熱處理法。三、固定化方法1.吸附法利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。物理吸附法常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用于靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，1）凝膠包埋法

凝膠包埋法是應用最廣泛的固定化方法

主要用包埋載體：瓊脂凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠，明膠，聚丙烯酰胺凝膠2）微膠囊法微膠囊固定化酶通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體，比凝膠包埋顆粒要小得多，底物和產物擴散阻力較小，但是反應條件要求高，制備成本也高。界面沉淀法或稱相分離法利用某些聚合物在水相和有機相溶解度極低而形成薄膜將酶包埋。界面聚合法利用親水性單體和疏水性單體在界面發生聚合的原理包埋酶二級乳化法脂質體包埋法由表面活性劑和卵磷脂等形成液膜包埋酶1）離子鍵結合法在適宜的pH和離子強度條件下，酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法，因而也稱離子交換吸附法。離子結合法的優點是：操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率高的固定化酶。缺點是：載體和酶的結合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強度高的條件下進行反應時，酶往往會從載體上脫落。2)共價結合法共價結合法是指借助共價鍵將酶的活性非必需側鏈基團和載體的功能基團進行偶聯的固定化方法。載體有：天然高分子衍生物，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖等；人工合成的高聚物，如聚丙烯酰膠、多聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐的共聚物、聚苯乙烯、尼龍等

酶和載體的偶聯反應有多種，取決于載體上的功能基團與酶分子上的非必需側鏈基團。載體上的功能基團和酶分子上的非必需側鏈基團間不具有直接反應的能力，所以要通過兩類方法來解決：一是將載體有關基團活化，然后與酶有關基團發生偶聯反應；另一種是在載體上接上一個雙功能試劑，然后將酶偶聯上去。溴化氰法：對于帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等來說，這是最常用的反應。芳香烴化反應：含羥基的載體也可在堿性條件下和三氯均三嗪等反應，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚基或巰基等偶聯。疊氮反應：適用于含羥基、羧甲基等的載體，如CM—纖維素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯－順丁烯二酸酐共聚物等。保護措施：應選擇適宜的固定化方法與相應的載體，例如，采用重氮法時要注意載體的親水性與疏水性，嚴格控制反應條件，提高反應的專一性，例如使反應局限于α-氨基，保護ε-氨基，應用可逆抑制劑或底物，封閉或牽制酶的活性中心與必需基團，避免試劑影響酶的活性構型和相應基團。4.交聯法交聯法是指利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進行交聯反應，以共價鍵制備固定化酶的方法。它與共價結合法的不同之處是它不使用載體。

交聯法的優點是操作簡便，其缺陷則是交聯反應的過程往往比較激烈，許多酶易在固定化過程中失效，酶回收率不高。

1)采用某些保護措施

2)盡可能降低交聯劑濃度和縮短反應時間，有利于固定化酶比活力的提高。5.熱處理法6.各種固定化酶方法的優缺點比較3．酶的最適溫度4．酶的最適pH5．酶的動力學特征6．酶的作用專一性1．酶的活力固定化酶(細胞)的活力即是固定化酶(細胞)催化某一特定化學反應的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應的反應初速度來表示。固定化酶(細胞)的單位可定義為：每毫克干重固定化酶(細胞)每分鐘轉化底物(或生產產物)的量，四、固定化酶的評價指標測定方法分為間歇測定和連續測定兩種1)間歇測定

在攪拌或振蕩反應器中，與溶液酶同樣測定條件下(如均勻懸浮于保溫的介質中)進行，然后間隔一定時間取樣，過濾后按常規酶活測定方法進行測定。

2)連續測定

將固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液。2．蛋白總量(1)雙辛可寧酸法(BCA法)

(2)考馬斯亮藍法3．偶聯率及相對活力偶聯率＝(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)／加入蛋白活力X100％

活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力×100％

相對活力＝固定化酶總活力／(加入酶的總活力一上清液中未偶聯酶活力)X100％4．半衰期固定化酶(細胞)的半衰期是指在連續測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經歷的連續工作時間，以t1/2表示。將細胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細胞固定化技術。被限制或定位于特定空間位置的細胞稱為固定化細胞。第二節細胞、原生質體固定化一、固定化細胞的特點具有固定化酶的特定，同時又具有自身的優勢：固定化細胞保持了細胞的完整結構和天然狀態，穩定性好保持了細胞內的酶系統、輔酶體系和代謝調控體系，可以按照原來的代謝途徑進行新陳代謝，并進行有效的代謝調節控制發酵穩定性好，可以反復使用或者連續使用較長的一段時間固定化細胞密度提高，可以提高產率提高固定化工程菌的質粒穩定性缺點：必須保持菌體的完整，防止菌體的自溶，否則影響產物的純度必須抑制細胞內蛋白酶對目的酶的分解胞內多酶的存在，會形成副產物載體、細胞膜或細胞壁會造成底物擴散的障礙等二、固定化細胞的分類分類方法類型細胞類型微生物、植物、動物生理狀態死細胞；完整細胞，細胞碎片，細胞器活細胞：增殖細胞，靜止細胞饑餓細胞三、細胞固定化方法1．包理法操作簡便包埋條件溫和形成的凝膠有一定的機械強度2.吸附法四、固定化細胞的性質

一方面固定化對酶產生的某些影響同樣對細胞起作用由于細胞內環境的相對恒定和細胞的“緩沖作用”，固定化對細胞胞內酶產生的影響在某些方面不像對游離的自然酶那樣