2010級五年制本科生

免疫學(xué)實驗課王慧文小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離及免疫細(xì)胞化學(xué)染色原理：抗原抗體反應(yīng)＋免疫標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用：細(xì)胞的蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行亞細(xì)胞水平的定位；觀察抗原分布；比較不同抗原的分布差異；設(shè)立對照后可檢測細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的相對量。檢測方法：示蹤物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度可在光鏡或電鏡下進(jìn)行定性或定位觀察。實驗原理Primaryantibody(Ab1)AntigenspecificityEnzyme免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)基本步驟細(xì)胞樣本的制備細(xì)胞樣本的固定免疫染色檢測細(xì)胞樣本固定的目的防止抗原丟失。提高細(xì)胞膜的通透性，使抗體進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。盡量使抗原保持能與抗體結(jié)合的狀態(tài)。維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)。實驗?zāi)康臋z測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面細(xì)胞膜分子CD68的表達(dá)情況實驗材料器材名稱量試劑名稱量1ml5ml注射器各1支含10%FCS的培養(yǎng)液1瓶/室3%H2O2-甲醇液1瓶/室培養(yǎng)液1瓶/室剪刀、鑷子1套5%BSA1瓶/室滴管（配膠帽）1支/組PBS1瓶/室EP管2個抗CD68抗體1只/室載玻片2張HRP標(biāo)記的二抗1只/室加樣器（1000/20ul）1把/室DAB顯色緩沖液1.5ml加樣器頭1盒/室加樣器（200ul）1把/組倒置顯微鏡1臺/室溫箱1臺/室酒精棉若干/室濕盒1臺/室四人一組小鼠1只/組小鼠脫頸處死，剪開表皮后腹腔注射2ml培養(yǎng)液，輕揉腹部后用滴管吸出1ml放入EP管中。每組兩張載玻片（每張載玻片上已粘有2張圓形蓋玻片，用于巨噬細(xì)胞貼壁），寫好組別后，一張寫CD68，一張寫PBS，用加樣器取腹腔液各50ul加在載玻片上，再加入BSA50ul，小心放在濕盒中，37℃溫箱孵育30min，PBS輕輕沖洗。滴加一滴3%H2O2-甲醇液室溫10min，PBS輕輕沖洗。一張載玻片加抗CD68抗體50ul，另一張加PBS50ul作對照，溫箱孵育60min，PBS沖洗。各加50ul二抗，37度溫箱避光孵育30min，PBS沖洗3次，每次2min。加入DAB顯色液各一滴，避光室溫顯色5min后顯微鏡下觀察。實驗步驟腹腔巨噬細(xì)胞染色細(xì)胞因子的檢測技術(shù)生物活性檢測免疫學(xué)檢測分子雜交PCR檢測生物活性檢測免疫學(xué)檢測分子雜交PCR檢測免疫印跡

(Westernblotting)Westernblotting

是一種在固相膜上如硝酸纖維素(NC)膜進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。蛋白質(zhì)經(jīng)過電流作用后，可以從膠轉(zhuǎn)移至膜上，再與特異性抗體孵育，洗去游離的抗體，然后和酶標(biāo)記的二抗孵育，進(jìn)行底物顯色。由于抗原抗體反應(yīng)特異性好，親合力高，Westernblotting檢測的靈敏度較高。實驗步驟SDSProteinBlottingImmuno-DetectionWesternblotting示意圖

+-MSample+-濃縮膠分離膠SDS(聚丙烯酰胺凝膠電泳)MSample蛋白印跡(ProteinBlotting)GelMembraneMSample轉(zhuǎn)印安裝示意圖吸水紙5張吸水紙5張注意：膜和膠的位置不能放反，且膜略大于膠。膜膠硝酸纖維