基因工程的基本操作程序現在是1頁\一共有52頁\編輯于星期三基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定現在是2頁\一共有52頁\編輯于星期三目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。基因操作的基本步驟一、目的基因的獲取——將需要的基因從供體生物

的細胞內提取出來。供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶現在是3頁\一共有52頁\編輯于星期三原核細胞的基因結構(補充內容）非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質。：編碼蛋白質,連續不間斷編碼區非編碼區原核細胞的基因結構②調控遺傳信息表達,上游有啟動子，下游有終止子啟動子現在是4頁\一共有52頁\編輯于星期三真核細胞的基因結構（補充內容）編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子啟動子終止子編碼區上游編碼區下游真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區和內含子現在是5頁\一共有52頁\編輯于星期三原核細胞真核細胞不同點編碼區是_____的編碼區是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調控作用的______區組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較連續不連續編碼區非編碼現在是6頁\一共有52頁\編輯于星期三1．下列關于基因結構的認識中，正確的是（）A．大豆基因中內含子是能夠編碼蛋白質的序列B．乳酸菌與酵母菌基因結構中都存在外顯子和內含子C．大腸桿菌基因與RNA聚合酶結合位點位于編碼區的下游D．水稻細胞基因的編碼區中存在非編碼序列2．（多選）原核細胞與真核細胞基因結構的共同特點是（）A．編碼區都有能編碼蛋白質的序列B．編碼區都是連續的C．非編碼區都能調控遺傳信息的表達D．非編碼區都有RNA聚合酶結合的位點DACD現在是7頁\一共有52頁\編輯于星期三一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質的基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術擴增3、人工合成閱讀教材P8-11如：與生物抗逆性相關的基因、與優良品質相關的基因、與生物藥物和保健品相關的基因、與毒物降解相關的基因、與工業用酶相關的基因等也可以是具調控作用的因子等。現在是8頁\一共有52頁\編輯于星期三(1)從基因文庫中獲取目的基因什么是基因文庫？什么是基因組文庫？什么是部分基因文庫？怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？目的基因的有關信息與什么相聯系？現在是9頁\一共有52頁\編輯于星期三概念：基因文庫（genelibrary）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)現在是10頁\一共有52頁\編輯于星期三基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.現在是11頁\一共有52頁\編輯于星期三基因組文庫與部分基因文庫的關系現在是12頁\一共有52頁\編輯于星期三提取某種生物的全部DNA用適當的限制酶酶切一定大小的DNA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導入受體菌中儲存（2）.基因文庫的構建方法①基因組文庫的構建現在是13頁\一共有52頁\編輯于星期三思考：基因文庫如何構建？

如果用某種生物發育的某個時期的mRNA反轉錄產生的多種互補DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就構成了這種生物的cDNA文庫。這種方法稱——反轉錄法現在是14頁\一共有52頁\編輯于星期三提取某種生物的某器官或特定發育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉錄酶DNA聚合酶導入受體菌中儲存②

cDNA文庫的構建-----逆轉錄法：

現在是15頁\一共有52頁\編輯于星期三mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉錄（cDNA）DNA聚合酶現在是16頁\一共有52頁\編輯于星期三真核生物的基因用逆轉錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？原核生物基因呢？思考？現在是17頁\一共有52頁\編輯于星期三基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較現在是18頁\一共有52頁\編輯于星期三基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較現在是19頁\一共有52頁\編輯于星期三依據：目的基因的有關信息。如：根據基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉錄產物mRNA

基因表達產物蛋白質等特性（4）從基因文庫中得到目的基因的方法——直接分離法(鳥槍法)現在是20頁\一共有52頁\編輯于星期三1、構建基因組DNA文庫時，首先應分離細胞的A、染色體DNA

B、線粒體DNAC、總mRNA

D、tRNA2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關基因文庫的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個基因文庫B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導入某個生物體內，則這個生物就是一個基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫AC現在是21頁\一共有52頁\編輯于星期三（2）利用PCR技術擴增目的基因PCR——聚合酶鏈式反應是一項生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。通過此技術，可獲取大量的目的基因。現在是22頁\一共有52頁\編輯于星期三PCR技術原理：前提：原料方式PCR擴增儀DNA復制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環的次數）指數2n模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；TaqDNA聚合酶；離子現在是23頁\一共有52頁\編輯于星期三

過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸現在是24頁\一共有52頁\編輯于星期三1、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數量增多，可用PCR技術進行人工復制，復制時應給予的條件是①雙鏈DNA分子為模板②ATGTG或TACAC模板鏈③四種脫氧核苷酸④四種核苷酸⑤DNA聚合酶⑥熱穩定DNA聚合酶⑦引物⑧溫度變化⑨恒溫A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D2、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌呤脫氧核苷酸是460個）放入DNA擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數是A.540個 B.8100個 C.17280個 D.7560個B現在是25頁\一共有52頁\編輯于星期三（3）人工合成——根據已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成現在是26頁\一共有52頁\編輯于星期三1、在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是A、化學合成法

B、基因組文庫法C、cDNA文庫法

D、聚合酶鏈反應2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術擴增目的基因③反轉錄法④通過DNA合成儀利用化學方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD現在是27頁\一共有52頁\編輯于星期三3、目的基因主要是指_______________的結構基因。獲得目的基因的常見方法有三種：（1）從基因文庫中獲取目的基因，根據基因的_________序列，基因在________上的位置，基因的________產物mRNA，基因的_______產物蛋白質等獲取目的基因。（2）利用PCR技術擴增目的基因，該技術是一項在________完成的核酸合成技術，前提條件是有一段已知目的基因的________序列，以便于合成_________。（3）如果基因較小且核苷酸序列已知，可以通過____________方法。編碼蛋白質核苷酸染色體轉錄表達體外核苷酸引物人工合成現在是28頁\一共有52頁\編輯于星期三二、基因表達載體的構建——核心（1）用一定的_________切割質粒，使其出現一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:現在是29頁\一共有52頁\編輯于星期三質粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達載體同種1.過程:現在是30頁\一共有52頁\編輯于星期三2、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？現在是31頁\一共有52頁\編輯于星期三不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；（3）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；（5）有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。現在是32頁\一共有52頁\編輯于星期三3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因位于基因的首端,是mRNA結合位點位于基因的末端,終止轉錄檢測目的基因是否導入受體細胞現在是33頁\一共有52頁\編輯于星期三1、（多選）一個基因表達載體的構建應包括A．目的基因B．啟動子C．終止子D．標記基因ABCD2、下列關于基因表達載體的敘述不正確的是A．啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼B．啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對mRNA的轉錄起調控作用C．標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別A3、目前轉基因工程可以A.打破地理隔離但不能突破生殖隔離B.打破生殖隔離但不能突破地理隔離C.完全突破地理隔離和生殖隔離D.部分突破地理隔離和生殖隔離C現在是34頁\一共有52頁\編輯于星期三常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因導入受體細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。三、將目的基因導入受體細胞吸附、注入、合成、裝配、釋放現在是35頁\一共有52頁\編輯于星期三1、將目的基因導入植物細胞（1）農桿菌轉化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質粒的T—DNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上轉化過程:Ti質粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉入農桿菌現在是36頁\一共有52頁\編輯于星期三（2）基因槍法

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。現在是37頁\一共有52頁\編輯于星期三（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。現在是38頁\一共有52頁\編輯于星期三2、將目的基因導入動物細胞方法:顯微注射技術操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發育新性狀動物現在是39頁\一共有52頁\編輯于星期三3、將目的基因導入微生物細胞常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA現在是40頁\一共有52頁\編輯于星期三1、基因工程中科學家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是A．結構簡單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質含量少、簡單D．性狀穩定、變異少2、基因工程常用的受體細胞有①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動植物細胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3、基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是A.人工合成基因B.目的基因與運載體結合C.將目的基因導入受體細胞D.目的基因的檢測和表達C現在是41頁\一共有52頁\編輯于星期三4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是①將毒素蛋白質注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中④將編碼毒素蛋白的DNA序列與質粒重組，導入細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養A．①②B．②③C．③④D．①④C5.下列屬于基因工程中導入目的基因方法的是①農桿菌轉化法②基因槍法③花粉管道法④顯微注射法⑤胚胎移植⑥DNA分子雜交法A．①②③④⑤⑥B．①②③④⑤C．①②③④D．①③④⑤⑥C現在是42頁\一共有52頁\編輯于星期三(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①導入檢測：目的基因是否導入受體細胞方法——DNA分子雜交②表達檢測轉錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定現在是43頁\一共有52頁\編輯于星期三知識延伸——DNA分子雜交技術該方法是根據堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。現在是44頁\一共有52頁\編輯于星期三返回現在是45頁\一共有52頁\編輯于星期三1、用β-珠蛋白的DNA探針可以檢測出的遺傳病是A．鐮刀狀細胞貧血癥B．白血病C．壞血病D．苯丙酮尿癥A2、應用基因工程技術診斷疾病的過程中必須使用基因探針才能達到檢測疾病的目的。這里的基因探針是A．用于檢測疾病的醫療器械B．用放射性同位素或熒光分子等標記的DNA分子C．合成β-珠蛋白的DNAD．合成苯丙羥化酶的DNA片段BA現在是46頁\一共有52頁\編輯于星期三思考與探究：2.根據農桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理,你能分析出不能導入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因導入小麥中,理論上講你應該怎樣做?①要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導的物質，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農桿菌的Vir區（誘導）的基因，使T-DNA轉移并插入到染色體DNA上。3.利用大腸桿菌可以生產出人的胰島素，聯系前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網和高爾基復合體上加工完成的，內質網和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產這種糖蛋白是不可能的。現在是47頁\一共有52頁\編輯于星期三4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產出鼠的β-珠蛋白，想一想，應如何進行設計？（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環素的基因，構建成一個表達載體。（3）將表達載體導入無四環素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環素的培養基上培養大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會不含有抗四環素基因而死掉；如果培養基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進入其中。（4）培養進入了β-