衛生微生物檢測方法1第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三本章主要內容第一節衛生微生物檢測的特點及基本原則第二節衛生指示微生物第三節衛生微生物研究和檢測的方法第四節衛生微生物研究和檢測方法發展前景2第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三第一節

衛生微生物學檢測的特點與基本原則檢測特點：檢測對象：致病、非致病、條件致病微生物標本來源：人體、環境環境中致病微生物數量少，需要特異的檢測方法，并且多依靠衛生指示微生物檢測原則：樣品的采集原則樣品的運送原則實驗室檢驗原則3第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三一、樣品的采集原則（一）樣品必須要有代表性:采樣量：滿足檢測要求采樣部位：均勻采樣采樣時間：便于分析微生物的動態變化采樣批號：盡量檢測每個批號4第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三（二）避免對樣品的污染器材滅菌、無菌操作（三）避免對樣品中微生物的殺滅和抑制避免有毒物質的殘留和高溫影響（四）對樣品進行詳細的標記這是基本要求（1）所有盛樣容器必須有和樣品一致的標記。在標記上應記明產品標志與號碼和樣品順序號以及其他需要說明的情況。標記應牢固，具防水性，字跡不會被擦掉或脫色。（2）當樣品需要托運或由非專職抽樣人員運送時，必須封識樣品容器。5第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、樣品的運送原則盡快送檢一般3-4h內送檢，減少細菌死亡和進一步繁殖帶來的影響。如不能及時運送，應根據樣品性質采取常溫冷暗、0-4℃冰箱、-15℃以下冰箱或冷藏庫內保存。注意保護待檢的微生物一定的溫度加保護劑或去除不利因素運送培養基（運輸緩沖液）：如病毒、厭氧菌等6第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三根據生物安全規定，妥善包裝待運輸的標本進行完善的樣品交接必須有樣品送檢單，與實驗室人員逐項核對后交接7第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三三、實驗室檢驗原則

1.具有相應的實驗室硬件設施

WHO對微生物危害性的分級

生物安全等級（biosafetylevel,BSL）BSL-1（P1實驗室）：檢驗非致病微生物。BSL-2（P2實驗室）：檢驗一般致病微生物。BSL-3（P3實驗室）：可檢驗特殊危險致病微生物。BSL-4（P4實驗室）：可檢驗危害性最嚴重的病原體。8第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三世衛組織感染性微生物的危險度等級分類危險度等級一級無或極低的個體和群體危險不太可能引起人或動物致病的微生物危險度等級二級個體危險中等，群體危險低病原體能引起人或動物的疾病，但不太可能對實驗室工作人員、社區、牲畜或環境造成嚴重危害。實驗室暴露也許會引起嚴重感染，但是對感染有有效的預防和治療措施感染傳播的危險有限第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三世衛組織感染性微生物的危險度等級分類危險度等級三級個體危險高，群體危險低病原體通常能引起人或動物的嚴重疾病，但一般不會發生感染個體向其他個體的傳播對感染有有效的預防和治療措施危險度等級四級個體和群體的危險均高病原體通常能引起人或動物的嚴重疾病，并且很容易發生個體之間的直接或間接傳播一般沒有有效的預防和治療措施第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三BSL-1不太可能引起人類疾病或獸醫學意義的無疾病安全措施：參照標準微生物學安全操作（=標準預防措施）。預期的安全設備：不需要，所以也不需要生物安全柜實驗室設備要求：需要開放實驗臺和水槽。第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三BSL-2對群體中出現的中等危險和人類疾病有關系的的微生物。危險性在于皮膚損傷、攝食、黏膜暴露。這一防護級別代表的微生物為：金黃色葡萄球菌、沙門菌、輪狀病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒等。第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三安全措施：參照一級生物安全實驗室操作，+進入受限生物危害警告標志“銳器”防范措施清除污染生物安全手冊預期的安全設備：在操作產生噴濺或氣溶膠的感染微生物時，使用驗收過的物理防護設備，如I級或II級生物安全柜。BSL-2第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三PPE（個體防護裝備）：根據需要穿戴實驗室大褂、手套和面部保護用具。實驗室設備要求：需要開放實驗臺、水槽和高壓滅菌器。BSL-2第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三高壓滅菌器洗眼器BSL-2第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三對本地或外來的呼吸傳播微生物（氣溶膠）以及可能引起嚴重的或潛在致命感染的微生物。這一防護級別代表的微生物為：結核桿菌、炭疽桿菌、霍亂弧菌、高致病性禽流感病毒、黃熱病病毒、艾滋病病毒等。重視環境和實驗室人員的保護屏障。BSL-3第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三安全措施：參照二級生物安全實驗室操作，+進入控制全部廢棄物均清除污染實驗室服裝在洗熨前須清除污染免疫血清基線預期的安全設備：對于所有開放性微生物操作使用I級或II級生物安全柜。BSL-3第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三PPE（個體防護裝備）：根據需要穿戴實驗室大褂、手套和呼吸器。實驗室設備要求：二級生物安全實驗室要求+實驗室與公共走廊通道在物理上分開門自動關閉，雙門入口排出廢氣不可再循環實驗室內負壓BSL-3第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三對于危險的或外來的微生物，它們是危及生命的很高個體危險，通過氣溶膠或未知傳播風險的微生物進行傳播，而且目前尚無疫苗或治療。這一防護級別代表的微生物為：天花病毒、埃博拉病毒。危險性在于呼吸暴露接觸到傳染性的氣溶膠、黏膜，或是暴露的損傷皮膚接觸到傳染唾沫。BSL-4第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三安全措施：參照三級生物安全實驗室操作，+進入前更換衣服出口處淋浴離開實驗室時，全部物品都要清除污染預期的安全設備：全部操作程序均在III級生物安全柜內進行，或者穿正壓供氣的的連體防護服（Hazmat套服）并I級和II級生物安全柜。BSL-4第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三實驗室設備要求：三級生物安全實驗室要求+獨立的建筑或明確劃分出的隔離區域專用進排氣、真空和清除污染系統安全文件明確規定的其他附加要求重點防止活性微生物污染環境BSL-4第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三微生物危險度等級與生物安全水平、操作和設備的關系危險度等級生物安全水平實驗室類型實驗室操作安全設施1基礎–一級生物安全水平基礎的教學、研究GMT不需要；開放實驗臺2基礎–二級生物安全水平初級衛生服務；診斷、研究GMT+加防護服、生物危害標志開放實驗臺，此外需生物安全柜用于防護可能生成的氣溶膠GMT=微生物學操作技術規范第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三微生物危險度等級與生物安全水平、操作和設備的關系危險度等級生物安全水平實驗室類型實驗室操作安全設施3防護–三級生物安全水平特殊的診斷、研究在二級生物安全防護水平上增加特殊防護服、進入制度、定向氣流生物安全柜和／或其他所有實驗室工作所需要的基本設備4最高防護–四級生物安全水平危險病原體在三級生物安全防護水平上增加氣鎖入口、出口淋浴、污染物品的特殊處理Ⅲ級生物安全柜或Ⅱ級生物安全柜并穿著正壓防護服、雙開高壓滅菌器（穿過墻體）、經過濾的空氣第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三2.具有合格的人員和標準檢驗方法人員要有資質，并經常接受培訓采用國家標準方法或公認方法（WHO、EPA等）3.加強實驗室質量控制儀器、設備、試劑：定期檢定和校準注意記錄和核查：如GLP實驗室報告規范：數據規范，完整簽名蓋章三、實驗室檢驗原則24第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4.實驗室應有應急措施應對突發事件能力需做多種檢驗時，微生物優先恰當的樣品處理與檢驗三、實驗室檢驗原則25第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三第二節

衛生檢驗中的指示微生物指示微生物（indicatormicroorganism）定義：在常規衛生監測中，用以指示檢品衛生狀況及安全性的（非致病）微生物（或細菌）。設定指示微生物的原因微生物（包括致病和非致病的）種類繁多，不可能一一檢測環境中致病微生物往往數量少，檢測困難，需要用相對易于檢測的微生物來間接反映。26第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三一、指示微生物的選擇選擇原則數量大、易于檢出，方法簡單，有代表性。指示微生物的種類：反映微生物綜合污染：細菌、霉菌和酵母菌落總數反映微生物污染來源：糞便污染指示菌（大腸菌群、糞大腸菌群等）；空氣污染指示菌（溶血性鏈球菌等）不得檢出的致病微生物間接反映致病微生物：如反映腸道病毒的噬菌體等消毒效果指示菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌（壓力蒸汽滅菌）；短小芽孢桿菌（電離輻射滅菌）；枯草桿菌黑色變種芽孢（環氧乙烷滅菌）27第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、常用的指示微生物（一）綜合污染指標——菌落總數定義：單位量的被檢樣品(g、ml、cm2、

m3)內，所含有的能在某種培養基上經一定條件、一定時間培養后生成的菌落數量。表述：細菌菌落總數、霉菌和酵母菌菌落總數。cfu/g、cfu/ml。(cfu，colonyformingunit)意義：綜合判定檢樣被微生物污染程度。方法：標準平板計數法、表面涂布法28第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三（二）來源污染指標——糞便、空氣污染指示菌

糞便污染指示菌的選擇標準是人及溫血動物腸道正常菌群的組成部分，且數量大。在糞便污染的樣品中易檢出，未被污染的樣品中無此菌存在。排出體外后，在外環境存活時間與腸道致病菌大致相似或稍長。在外環境中不繁殖。如作為飲用水的指示菌，對氯、臭氧等抵抗力應不低于腸道致病菌或略強。檢驗方法簡便，易于檢出和計數。29第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三常見糞便污染指示菌1.大腸菌群（coliformgroup）概念：指一群需氧的或兼性厭氧的，在35-37℃24h培養能分解乳糖產酸產氣的G-無芽孢桿菌。種類：大腸埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、沙雷菌屬、變形桿菌屬某些種等。衛生學意義評價檢樣衛生質量，推斷有無腸道致病菌污染。總大腸菌群（totalcoliform）—37℃培養生長的大腸菌群。糞大腸菌群（fecalcoliform）（耐熱大腸菌群）—44-45℃能發酵乳糖的大腸菌群。方法：發酵法，濾膜法，紙片法30第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三大腸菌群作為指示菌的一些新問題大腸菌群“受損”對細菌計數的影響大腸埃希菌的致病性大腸菌群中某些細菌可以在外界繁殖大腸菌群的檢測范圍有限水中大腸菌群>200cfu/100ml小腸結腸炎耶爾森菌陽性率6.4%水中大腸菌群<200cfu/100ml小腸結腸炎耶爾森菌陽性率8.9%31第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三2大腸埃希菌(Escherichaecoli)檢出意義最大鑒定方法較復雜藥品行業使用較多近年應用較多作為糞便污染指示菌，大腸埃希菌檢出意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群再次32第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三3.腸球菌(Enterococcus)（糞鏈球菌)人及動物腸道正常菌群。在人糞數量僅次于大腸菌群細菌，動物糞便中所占比例高。對惡劣環境抵抗力較強，營養水體繁殖力低于大腸菌群。單獨檢查不能作為糞便污染的決定性指標，但可提供有價值的補充材料。判斷污染來源。

方法：耐熱大腸菌群與腸球菌之比＞4.1污染來源人耐熱大腸菌群與腸球菌之比＜0.7污染來源動物耐熱大腸菌群與腸球菌之比4.1～0.7混合來源33第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三4產氣莢膜梭菌(Costirdia)G+有芽孢，還原亞硫酸鹽的厭氧桿菌。外界環境抵抗力較強。不適合作為主要指標，但可提供有價值的補充材料。特別適合水樣不能及時送檢，或在含有有毒物質（氯）的環境中檢測是否有過糞便污染。產氣莢膜梭菌（＋）大腸菌群（＋）新近污染產氣莢膜梭菌（＋）大腸菌群（－）陳舊污染34第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三常見空氣污染指示菌：口腔和鼻腔的鏈球菌（無人居住的房屋空氣中沒有鏈球菌，房屋內住人越多，鏈球菌的含量亦越高）。一般用草綠色鏈球菌與溶血性鏈球菌合起來計算。35第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三（三）不得檢出的致病菌微生物主要危害主要指示作用沙門菌腸道致病菌口服藥、食品不得檢出志賀菌菌痢食品不得檢出金葡菌局部化膿、食物中毒食品、化妝品、外用藥不得檢出；游泳池水指標菌銅綠假單胞菌條件致病菌外傷、眼科用藥、化妝品不得檢出，游泳池水指標菌破傷風梭菌外傷皮膚感染外用藥不得檢出36第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三（四）間接反映致病微生物存在的指示菌腸道病毒指示微生物的條件：檢驗方法簡單操作安全在被人腸道病毒污染的環境中一定存在，數量等于或大于腸道病毒的數目對于消毒劑和外環境的抵抗力應與腸道病毒一致或稍強。

37第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三腸道病毒的指示微生物

指示物優點缺點應用大腸桿菌噬菌體f2與腸道病毒耐受性相似；存在于人糞中；檢測較簡便糞便中數量少；可能在環境中繁殖；檢測結果受大腸桿菌DNA噬菌體影響水中病毒消毒效果評價指標脊髓灰質炎病毒減毒疫苗株Ⅰ操作安全非所有糞便有；檢測困難應用于消毒學和水中病毒研究38第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三第三節

衛生微生物研究和檢測的方法（一）樣品的處理（二）損傷菌的復蘇（三）選擇性增菌與分離（四）定量計數方法（五）分型鑒定的方法（六）其他分子生物學方法39第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三混勻樣品（非常重要）液體：電動混勻、手搖混勻、敲打混勻固體：攪碎混勻、研磨混勻、勻漿混勻樣品濃縮沉淀法過濾法吸附沉淀法一、樣品的處理40第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三環境樣品微生物，在采樣送檢等過程中，受各種不利因素作用，可發生亞