基因工程病毒疫苗第1頁/共57頁愛德華首先采用接種牛痘預防天花第2頁/共57頁一、疫苗的起源與發展2、發展階段（1）20世紀前30年卡介苗（BCG）：結核菌減毒苗白喉/破傷風疫苗：化學滅活疫苗流感疫苗：禽胚中研制成功（2）二次世界大戰后：多種減毒和滅活病毒疫苗研制成功：脊髓灰質炎疫苗、腮腺炎疫苗、麻疹疫苗、風疹疫苗以及腦膜炎球菌、肺炎球菌、流感桿菌疫苗第3頁/共57頁一、疫苗的起源與發展3、20世紀80年代（分子技術推動的疫苗研制）重組乙肝疫苗細菌莢膜與載體蛋白偶聯疫苗細胞培養生產減毒或滅活疫苗4、我國的情況北京、上海、蘭州、成都、長春、武漢生物制品研究所實現計劃免疫接種第4頁/共57頁二、疫苗與基因工程疫苗1、疫苗（Vaccine)（1）傳統的定義：用人工變異或從自然界篩選獲得的減毒或無毒的活的病原微生物制成的制劑，或者用理化方法將病原微微生物殺死制備的生物制劑，用于人工自動免疫，使人或動物產生免疫能力。第5頁/共57頁二、疫苗與基因工程疫苗2、現代定義：是致病原的蛋白（多肽或肽）、多糖、或核酸，以單一成份或含有有效成份復雜顆粒的形式，或通過活的減毒致病原或載體，進入機體后能產生滅活、破壞或抑制病原的特異性免疫應答。國際上一般將細菌性制劑、病毒性制劑以及類毒素統稱為疫苗第6頁/共57頁二、疫苗與基因工程疫苗3、第一代疫苗通過改變培養條件，或在不同寄主動物上傳代使病原微生物毒性減弱。或通過物理化學的方法將其滅活來完成的。4、第二代疫苗（基因工程疫苗）利用DNA重組技術克隆并表達保護性抗原基因，利用表達的抗原產物或重組體本身制成的疫苗。（1）獲得大量高純度的抗原（2）安全第7頁/共57頁第二節病毒疫苗的種類一、傳統病毒疫苗1、滅活疫苗（死疫苗）：誘導產生IgG和IgM（1）優點：工藝簡單免疫原性穩定易于制備第8頁/共57頁（2）缺點保證不含有滅活不完全的顆粒；提供的免疫力短、常有不良過敏反應；不能誘生局部免疫抗體IgA,野生病毒仍可以到達侵入門戶。第9頁/共57頁2.減毒疫苗(弱毒疫苗）（1）定義：微生物的自然強毒株通過物理、化學的和生物學的方法，連續傳代，使其對原宿主喪失致病能力，或只引起亞臨床感染，但仍能保持良好的免疫原性、遺傳特性，用這種毒株的疫苗。（2）優點：可以誘發全面的免疫反應（體液免疫、細胞免疫）免疫力持久第10頁/共57頁（3）減毒方法體外減毒：異源宿主中連續傳代或單一宿主中反復連續傳代。冷適應篩選：將病毒在低溫下連續或逐步傳代，誘導病毒基因組多處突變或損傷，獲得毒力減弱和各種標志特征的冷適應株，以此制備的疫苗。第11頁/共57頁3.亞單位疫苗（1）定義：提取或合成細菌、病毒外殼的特殊蛋白結構，即抗原決定簇制成的疫苗。（2）優點：副作用小、不含核酸、安全性高第12頁/共57頁第13頁/共57頁第14頁/共57頁第15頁/共57頁4.衡量疫苗能否投入使用的標準安全性刪除致病基因，保留抗原性。有效性盡可能調動肌體細胞免疫和體液免疫。第16頁/共57頁5.免疫反應過程抗原抗原顯示細胞吞噬抗原抗原肽MHC蛋白抗原肽復合物

T細胞活化免疫細胞識別、活化

B細胞活化第17頁/共57頁活化T細胞→殺傷性T細胞活化B細胞

釋放淋巴因子分泌抗體

→殺滅抗原←第18頁/共57頁二、新一代病毒疫苗（遺傳重組疫苗）（一）基因工程疫苗定義：通過基因工程表達保護性抗原基因，利用表達產物或重組體本身制成的疫苗。種類：基因工程亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗第19頁/共57頁1：基因工程亞單位疫苗（1）定義：用基因工程表達的蛋白抗原純化后制作的疫苗。（2）優點：產量大純度高免疫原性好安全性高（3）制備亞單位疫苗的前提：鑒別出什么成分引起宿主免疫反應。第20頁/共57頁（4）提高免疫效果的方法不同基因組合、使表達成顆粒性結構；在體外加以聚團化，包入脂質體或膠囊微球；加入免疫增強劑（佐劑）；第21頁/共57頁2.基因工程載體疫苗（1）定義：將免疫原基因與載體DNA連接的重組載體轉入受體獲得增殖培養物供疫苗制備，或直接將活載體接種宿主，直接在體內表達抗原誘導免疫反應。（2）優勢：多為活載疫苗，抗原無需純化、載體本身有佐劑的作用；常用的載體有：痘病毒、腺病毒、脊灰病毒、霍亂弧菌、沙門菌、卡介苗；第22頁/共57頁多價或多聯疫苗：同時表達多種抗原（3）非復制型載體重組微生物進入機體后，只保留DNA的復制、轉錄與表達，但不產生感染性后代；（4）復制型載體的制作方法利用在人體中不能繁殖的動物病毒；（例桿狀病毒）通過DNA技術對微生物進行改造，使不能在人體中繁殖后代，但表達源基因的能力仍保留。第23頁/共57頁3.基因缺失活疫苗定義：通過基因操作將病原微生物中與致病性有關的毒力基因缺失，使之成為無毒株或弱毒株，但仍保持良好的免疫原性4.DNA疫苗（第三代免疫）Wolf（1993）將流感病毒核蛋白P抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引起免疫反應，產生多種亞型TK細胞。目前已經進行的研究：輪狀病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、狂犬病毒、結核桿菌亞單位疫苗等。（1）二個特點：DNA（帶有免疫原基因）、可起免疫作用第24頁/共57頁（2）優點：無感染性誘發產生天然抗原表位的抗體誘發特異性T細胞免疫反應持續免疫便于構建多價疫苗穩定性不受溫度影響純化容易有預防和免疫治療雙重功能可快速篩選具有免疫保護效果的基因能定向誘導輔助性T細胞(TH1、TH2)為主導的免疫反應第25頁/共57頁5.蛋白工程疫苗定義：對抗原基因進行改造或不同抗原基因進行組合，以期達到增強其產物的免疫原性、擴大反應譜、去除有害作用或副反應的一類疫苗第26頁/共57頁（二）、遺傳重組疫苗利用遺傳重組的方法獲得的重組微生物制成的疫苗。（三）合成肽疫苗又稱表位疫苗：利用化學合成的方法合成能誘發機體產生保護的多肽所制作的疫苗第27頁/共57頁（四）抗獨特型抗體疫苗（1）獨特型：抗體分子與抗原結合的高變區的獨特結構（2）抗獨特型抗體疫苗：使用與特定抗原免疫原性相近的抗抗體（Ab2）作抗原制成的疫苗（內影像疫苗）（五）微膠囊疫苗（可控緩釋疫苗）（1）用微膠囊技術將特定的抗原包裹后制成的疫苗。（2）微膠囊：丙交酯和乙交酯的共聚物制成，可干燥成粉狀顆粒。第28頁/共57頁第三節基因工程病毒疫苗的設計與制備一、設計策略1、理想疫苗的特點：有效、安全產生免疫快可大量生產貯存運輸方便價格合理第29頁/共57頁2、亞單位疫苗設計策略（1）抗原選擇能模擬誘生有效保護性抗體應答的抗原決定簇具有優勢免疫的抗原決定簇對人體安全特異性（2）表達載體及表達系統（按需要選擇）第30頁/共57頁3、基因工程載體疫苗的設計策略（1）抗原選擇：同上（2）疫苗載體的選擇選擇非致病性細菌或病毒作疫苗載體。A：理想疫苗載體的條件：感染靶細胞誘導機體產生免疫反應無毒力返祖：在不斷繁殖過程中出現自身修復（毒力回復）無大量排毒引起的環境污染生活史中不能與宿主染色體整合操作方便接種后不會長期在體外存留第31頁/共57頁B常見的疫苗載體痘苗病毒載體流感病毒載體Mengo病毒載體金絲雀痘病毒載體仙苔病毒載體皰疹病毒載體沙門菌卡介苗病毒載體細菌載體第32頁/共57頁4、基因缺失活疫苗的設計關鍵：選擇要刪除的靶基因，一般為復制非必需、毒力相關的基因5、核酸疫苗的設計策略基因選擇：主要保護性抗原基因分子佐劑：增強核酸疫苗激發免疫應答反應的細胞因子表達載體：表達抗原能力強的載體（啟動子、增強子、polyA信號第33頁/共57頁二、基因工程疫苗制備的技術路線1、基因工程亞單位疫苗制備的技術路線抗原基因選擇與分離構建重組載體轉化宿主（細胞）表達、純化第34頁/共57頁2、基因工程載體疫苗制備技術路線抗原基因選擇與分離插入疫苗載體系統（細菌或病毒）重組載體體外培養收獲培養物及后處理第35頁/共57頁3、基因缺失活疫苗制備技術路線選擇靶基因定向缺失靶基因基因缺失毒株的培養收獲病毒及后處理第36頁/共57頁4、核酸疫苗制備技術路線目的抗原基因的選擇與分離構建表達質粒轉入宿主細胞擴增純化重組質粒后處理第37頁/共57頁三、基因工程病毒疫苗的質量控制（1）注意：抗原基因、表達載體的變異和穩定性安全要求：重組后的基因產物無致病性、無毒性、無潛在危險有效性要求：保證表達后的蛋白具有良好的抗原性和免疫原性穩定性和重復性要求：同樣的方法可以重復生產和制造第38頁/共57頁（2）研制階段的要求：插入基因：所有的背景清楚、克隆過程清楚載體：背景（啟動子、復制子、抗藥性等）清楚宿主細胞：背景（來源、表型、遺傳型及相應的標記基因）清楚第39頁/共57頁第四節基因工程病毒疫苗的研發現狀一、需研制的基因工程病毒疫苗艾滋病乙型肝炎丙型肝炎戊型肝炎EBV肝炎人乳頭瘤病毒（宮頸癌）單純皰疹病毒巨細胞病毒呼吸道合胞病毒輪狀病毒登革熱病毒埃博拉病毒第40頁/共57頁二、重要病毒性疾病基因工程疫苗的研究進展1、艾滋病疫苗（AIDS）艾滋病全稱“獲得性免疫缺陷綜合癥(acquiredimmunodeficiencysyndrome)”，簡稱AIDS。1981年，首例艾滋病病例在美國同性戀人群中發現。“人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyvirus，HIV)”并確定艾滋病是由這種逆轉錄病毒(retroviruses)所引起。第41頁/共57頁第42頁/共57頁第43頁/共57頁The

transmissionrouteofHIV-1inChinaSHANXIFUJIANXIZHANGHEILONGJIANGJILINLIAONINGNEIMENGGUBeijingTianJinQINGHAIHEBEININGXIAGANSUSHANXIANHUIHENANSHANDONGShangHaiJIANGXIHUBEIJIANGSUHUNANGUANGDONGGUANGXIGUIZHOUHAINANYUNNANSICHUANTAIWANXINJIANGChongQingZHEJIANGCRF07-BCB’CRF01-AEB傳入我國C傳入我國CRF08-BC第44頁/共57頁RiskFactorsforCumulativeHIV/AIDScasesinChina

(1985-2004)Blood/productsMTCTBloodcollectionHetero/Homosex采血29.6%血液/血制品3.1%異性/同性8.2%靜注毒品42.0%母嬰傳播1.0%IDUsOthers不詳16.1%第45頁/共57頁HIV病毒在RNA基因組通過逆轉錄酶逆轉錄為DNA時,容易發生誤差。在與體內免疫系統相互作用的過程中,HIV不斷演化,結果產生病毒變異。變異的速度非常快據測定,HIV感染者體內每天至少產生108變異病毒,同一個體內不同病毒之間的差異可達10%～15%。第46頁/共57頁（1）HIV的生物學第47頁/共57頁A、病毒蛋白直徑約100nm的球狀病毒,粒子外包被著由兩層脂質構成的脂膜,(主要是gp41和gp120)的脂質源于寄主細胞的質膜。gp41：病毒衣殼的穿膜蛋白；gp120：病毒的主要衣殼糖蛋白，它與HIV成功感染有關。P17：膜內側面緊貼著蛋白質，核心部分是截去頭部的圓錐體，由蛋白質P24所構成的衣殼包裹。蛋白質P24和P18組成其核心。反轉錄酶。其功能是催化病毒RNA的反轉錄。第48頁/共57頁B、病毒基因Gag：編碼衣殼蛋白(Gag)Pol：病毒復制所必須的酶(P