本文格式為Word版，下載可任意編輯——漢族人群聚腺苷二磷酸核糖聚合酶

苷二磷酸核

目的：通過檢測人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（hPARP1）7個外顯子核苷酸多態性，了解在廣東的漢族人群中hPARP1基因多態性分布，為建立民族特色的DNA修復基因多態性數據提供基礎資料。方法：選取在廣東地區的漢族健康人群320名的基礎資料及血液樣本，抽提血液DNA，用PCR法擴增hPARP1基因7個外顯子，采用聚合酶鏈式反應（PCR）單鏈構象多態性(SSCP)和銀染技術檢測hPARP1基因多態性，并進行DNA序列測定。結果：在廣東的漢族正常人320名血標本的7個外顯子擴增產物SSCP電泳條帶中，4個樣本hPARP1基因外顯子17的SSCP電泳條帶檢出1條多態性條帶，3個樣本第12內含子檢出1條多態性條帶，其余6個外顯子擴增產物SSCP電泳未見多態性條帶。正常帶型DNA測序結果與genebank中已知序列完全一致，第17外顯子上有1種基因突變類型（TC）。結論：在廣東地區的漢族人群的hPARP1基因第17外顯子和第12內含子上可能存在多態性。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶－1；遺傳多態性；聚合酶鏈反應

Objective:Toinvestigatethenucleotidepolymorphismsanddistributionsofsevenexonsinhumanpoly(ADPribose)polymerase1(PARP1)geneandtocontributetotheconstructionofthespecialDNArepairgenepolymorphismsdatabank.Methods:Thebasicmaterialsandbloodsamplesfrom320GuangdonghealthHanpopulationwerecollected.Thepolymorphismofexon3,11,12,13,16,17andexon20ofhPARP1geneweredetectedbyPCRSSCP,andsequencingtestwereperformed.Results:Apolymorphismsofexon20ofPARP1genewasdetectedin320HanpeoplebyPCRSSCP,noabnormalbandswereobservedfromtheanalysisofPCRSSCPinotherexons.Also,DNAsequenceofnormalbandsturnedoutthatPCRproductsweretargetonesinGenebank,onetypemutations(TC)and(GA)weredetectedinexon17andinintron12.Conclusion:Polymorphismsmayexistinexon17andintron12ofhPARP1geneinGuangdongHanpopulation.PCRSSCPsilverstainingcouldbeasatooltoscreenrapidlythepolymorphismshPARP1gene.

poly(ADPribose)polymerase1;geneticpolymorphism;polymerasechainreaction

DNA修復系統在修復DNA損傷、維持基因組完整和穩定性中起著不容忽略的作用。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly(ADPribose)polymerase1，PARP1］是真核細胞中存在的一種蛋白質翻譯后修飾酶。可參與大量與細胞功能有關的重要反應，并與癌癥的發生、發展和治療、預后密切相關，對維持DNA的完整性方面起著重要的作用［1］，其多態位點的確認對疾病易感性的流行病學研究具有重大意義。基因檢測能有效篩查基因突變攜帶者，可以為進一步鑒定該突變功能上的意義提供基礎的分子遺傳學資料，因而具有重要的意義。本文應用PCRSSCP基因篩查技術和分子流行病學方法檢測了在廣東的漢族人群中正常人hPARP1基因的多態性，為hPARP1基因多態性人群分布和建立民族特色的DNA修復基因多態性數據庫提供基礎資料。現將結果報道如下。

1方法

1.1樣本收集

選取在廣東地區的健康狀況良好(通過體檢選擇取)、無家族史和遺傳病史、三代及以上均為漢族的320名個體（其中男174例，女146例，年齡38～67歲，平均年齡（43.156.70）歲）并取血樣標本。

1.2血液DNA的抽提［2］

采集外周抗凝全血5mL，用經典酚氯仿法提取外周血DNA，并在4℃保存。

1.3引物設計

根據已確定的hPARP1基因cDNA和內含子/外顯子連接序列，用PrimerPremier5.0引物設計軟件設計hPARP1基因7個外顯子的引物，該引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。表1擴增hPARP1基因外顯子的引物序列

1.4PCR擴增

PCR反應總體積為25L，各成分終濃度為：引物0.125mol/L，dNTP0.2mmol/L，Mg2+1.8mmol/L，DNA模板25～250ng，TaqDNA聚合酶2.5u。反應參數為：98℃預變性5min，94℃30s，53～59℃30s，72℃45s，30次循環后72℃延伸8min。以2％瓊脂凝膠對擴增產物進行鑒定。若與DNA分子量標準相比，擴增產物大小一致，無雜帶，則可用于單鏈構象多態性(SSCP)分析。

1.5SSCP分析

1.5.18％聚丙烯酰胺凝膠的配制40％丙烯酰胺8mL，10Tris/硼酸電泳緩沖液(TBE)4ml，10％過硫酸胺（AP）0.8mL，N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED)53L，甘油4mL，加水至40mL。將聚丙烯酰胺凝膠混合物倒入玻璃板夾層，插入梳子，讓凝膠在室溫下聚合40～50min，拔出梳子，沖洗樣孔。根據PCR產物的濃度，取0.2～2L產物參與20L甲酰胺變性液（98％去離子甲酰胺，0.05%溴酚藍和0.05%二甲苯青）中混勻，95℃熱變性5min，立刻置于冰上，點樣于預電泳30min的上述8％聚丙烯酰胺凝膠中，在4～8℃環境中300V電泳6～10h。

1.5.2銀染步驟參照文獻［3］進行(1)10％乙醇浸泡5min；(2)1％HNO3浸泡5min；(3)0.2％AgNO3浸泡20min；(4)顯影液(20mL1.4mol/L無水碳酸鈉＋50L甲醛＋80mL去離子水)，至條帶出現；(5)10％醋酸浸泡5min。以上每一步后均用去離子水洗2次，觀測結果并掃描成像保存。對陽性結果樣本進行2～3次PCRSSCP銀染重復試驗。

1.6DNA序列測定

對SSCP分析有異常泳動帶的外顯子，擴增DNA樣本，采用ABI377全自動基因分析儀對其進行DNA序列測定并與GeneBank中所報道的序列進行對比。

2結果

2.1DNA抽提結果

所抽提DNA樣本濃度及純度，均可用于后續試驗研究。

2.2PCR擴增

320份DNA樣本的hPARP1基因7個外顯子均得到成功擴增，各外顯子PCR反應產物均為單一條帶，大小在175～362bp之間，與預計擴增片斷大小一致(圖1)。

2.3SSCP分析

經PCRSSCP對7個外顯子進行遺傳多態性檢測，320名漢族人中有4名的外顯子17和3名測序檢出內含子12出現多態位點，出現2種穩定的帶型，顯示3條變性單鏈帶（異常泳動條帶位置在2條正常單鏈的中間），其余6個外顯子均未發現異常帶型，顯示2條變性單鏈帶（圖2）。

2.4測序

正常樣本7個外顯子雙向測序結果說明，所擴增序列分別與Genbank中hPARP1基因7個外顯子的符合率達到100％。4例異常樣本第17外顯子和3例異常樣本第12外顯子測序結果，所擴增序列有一處堿基發生突變，外顯子17在密碼子808處出現CACCGC，即組氨酸精氨酸；第12外顯子測序發現12內含子在18731位出現GA改變(圖3，圖4)。

1～8泳道分別為外顯子20、17、3、11、DNAMarkDL2000及外顯子12、13、16。

圖1PCR產物在2％瓊脂糖凝膠上電泳結果第6泳道為異常標本，其余泳道為正常標本；"'：正常單鏈，"'：異常單鏈。

圖2hPARP1基因外顯子17PCR產物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳圖

第12內含子的18731位出現GA的雜合性突變。

圖3第12內含子正向測序圖異常泳動條帶樣本第17外顯子反向測序結果：密碼子808出現TC的雜合性突變。

圖4第17外顯子反向測序圖3探討

PCRSSCP銀染技術是一種檢測基因突變十分敏感的方法。在大樣本量的分子流行病學研究中,往往需要對多個基因或同一基因的多個外顯子進行突變篩查,這種工作不僅工作量大,花費大,操作繁瑣,而且不易進行質量控制。本試驗結果說明，SSCP多重PCR法是一種快速檢測正常人群hPARP1基因多態性的有用技術。它比用于檢測基因突變的其它方法［4］，如變性梯度凝膠電泳法、限制性片段長度多態性和直接測序更簡單、更省財省力，適用于大樣本量人群的基因突變篩查和分子流行病學研究。

由于DNA單鏈的構像是未知的，SSCP的條件應基于不同大小的DNA片段，一般是靠經驗來決定的，同時電泳溫度和凝膠濃度能明顯影響電泳的速度和單鏈DNA分子的辨別率。SSCP不能確定堿基改變的確切數量或改變的位點，突變位點的確切定位必需依靠直接測序來完成。我們在SSCP檢測中發現有異常泳動條帶的樣本時，重新擴增其DNA進行序列分析，結果均有基因突變。由此可見，SSCP檢測結果與直接測序結果的符合率高。在所有320份標本中僅檢出4份樣本的第17外顯子上的突變位點，其余6個外顯子均未檢出突變位點。與本室以前研究結果［3］相比，檢出率有提高。這是與本試驗始終在同一電泳環境溫度(4℃)、凝膠濃度下對7個外顯子進行電泳有關，還是與抽樣有關呢？其確鑿原因有待進一步研究。

本研究用PCRSSCP法在320名廣東地區漢族人群中篩查出4名的hPARP1基因第17外顯子有一種錯義突變，檢出3例第12內含子有1種堿基突變發生。由于所檢測出的突變位點尚未見報道，因此無法與其他國家或民族的基因頻率進行對比。同時，第17外顯子基因頻率大于1