第十三章

PCR核酸擴增儀

(PCRnucleicacidAmplifier)教學基本要求掌握核酸擴增儀的工作原理和主要性能指標。掌握梯度PCR儀和原位PCR儀的功能和特點。掌握實時熒光定量PCR擴增儀的種類及特點。熟悉PCR技術的原理；PCR擴增儀的種類；熒光實時定量PCR（RQ-PCR）技術原理。了解PCR擴增儀的操作規程；PCR擴增儀常見故障的排除；PCR擴增儀的應用。內容提要第一節PCR核酸擴增儀的工作原理第二節PCR核酸擴增儀的分類與結構第三節PCR核酸擴增儀的性能指標、操作規

程及常見故障的排除第四節PCR核酸擴增儀的臨床應用第一節PCR核酸擴增儀的工作原理PCR技術的發展簡史PCR技術的原理核酸擴增儀的工作原理PCR技術的發展簡史

1953年，DNA雙螺旋結構被發現1963年，建立了核酸測序的方法

1971年Khorana最早提出核酸體外擴增的設想。PCR技術的發展簡史1971年，KjellKleppe等描述的一項基于酶的體外DNA復制實驗

。

1985年美國PE公司KaryMullis在開車前去北加利福尼亞紅樹縣的一條被月光籠罩的山路上構思了PCR。1993年，Mullis因此項技術獲諾貝爾化學獎。PCR技術的發展簡史

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow（克列諾）片段，該片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。PCR技術的發展簡史1988年，Keohanog改用T4DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。KeohanogKaryMullisSaikiPCR技術的發展簡史PCR技術的原理PCR技術的本質是核酸體外擴增加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復“變性→退火→引物延伸”過程至25～40個循環，呈指數級擴大待測樣本中的核酸拷貝數。PCR技術的原理PCR循環–

第一步–加熱變性PCR技術的原理PCR循環-

第二步–引物與模板DNA分子退火Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’PCR技術的原理PCR循環-

第三步-引物延伸Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR技術的原理第1個PCR循環完成后

——得到兩個拷貝的靶序列PCR技術的原理30次循環后靶序列擴增的數量循環數擴增產物量（2n）1 21＝22 22＝43 23＝84 24＝165 25＝326 26＝6420 220＝1,048,57630 230＝1,073,741,824PCR核酸擴增儀的工作原理PCR核酸擴增儀的工作關鍵是：溫度控制PCR核酸擴增儀的工作原理控溫方式離心式空氣加熱控溫

半導體控溫

壓縮機控溫

水浴鍋控溫

PCR儀的控溫方式水浴鍋控溫：第一代壓縮機控溫：第二代，金屬導熱，邊緣效應及overshooting和undershooting現象半導體控溫和離心式空氣加熱控溫：第三代第二節PCR核酸擴增儀的分類與結構普通定性PCR核酸擴增儀實時熒光定量PCR核酸擴增儀第二節PCR擴增儀的分類與結構PCR擴增儀的種類

原位PCR儀

梯度PCR儀

實時熒光定量PCR擴增儀

普通PCR擴增儀

普通定性PCR核酸擴增儀按照變溫方式分為以下三類：水浴式PCR儀變溫金屬塊式PCR儀變溫氣流式PCR儀

普通定性PCR核酸擴增儀

——水浴式PCR儀一般由三個不同溫度的水浴槽和機械臂組成。采用半導體傳感技術、電子技術和計算機技術進行水浴溫度的測量、顯示和控制并經計算機控制由機械臂完成樣品在每個水浴槽的置放以及槽間的移動。特點：儀器體積較大，但變溫快、時間準、溫度均一，目前國內應用較少。

普通定性PCR核酸擴增儀

——變溫金屬塊式PCR儀中心是由鋁塊或不銹鋼制成的熱槽，上有不同數目甚至不同規格的凹孔，用來放置樣品管。凹孔內壁加工精密，保證與樣品管緊密接觸。一般通過半導體加熱和冷卻，并由微機控制恒溫和冷熱處理過程，通過鍵盤和顯示器實現人機交流，并可編程、存儲或刪除程序。特點：儀器裝置比較牢固耐用，溫度變換平穩，有利于保持TaqDNA聚合酶的活性。普通定性PCR核酸擴增儀

——變溫氣流式PCR儀由機殼、熱源、冷空氣泵、控制器及輔助元件等組成。熱源由電阻元件和吹風機組成，形成熱空氣槍借空氣作為熱傳播媒介，由大功率風扇及制冷設備提供外部冷空氣制冷，精確的溫度傳感器構成不同的溫度循環。特點：儀器不用金屬精密加工，成本較低；整個系統沒有液體流動及制冷劑，安全程度高。配上微機和軟件，可靈活編程。

普通定性PCR核酸擴增儀按照功能用途可分為以下兩類：梯度PCR儀原位PCR儀

普通定性PCR核酸擴增儀

——梯度PCR儀由普通PCR儀衍生出的具溫度梯度功能的核酸擴增儀。多種變性溫度和延伸溫度可在一臺擴增儀上同時完成既節省實驗時間、提高實驗效率，又節約實驗成本。梯度PCR儀每個孔的溫度可以在指定范圍內按照梯度設置，根據擴增結果，一步就可以摸索出最適退火條件。

普通定性PCR核酸擴增儀

——原位PCR儀

是原位雜交與PCR技術的結合。在細胞內進行PCR擴增，而不破壞組織細胞的形態。解決了以往手工方法操作復雜，擴增效果及實驗結果重復性不理想的問題。與普通PCR儀的區別：其樣品基座上有若干平行的鋁槽，每條鋁槽內可垂直放置一張載玻片，每張載玻片面均與鋁槽緊密接觸，溫度傳導極佳，控溫很精確。實時熒光定量PCR核酸擴增儀ABI7500熒光定量PCR儀

MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀

Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀實時熒光定量PCR核酸擴增儀實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR，RQ-PCR)技術是在PCR反應體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號達到定量的目的。實時熒光定量PCR核酸擴增儀實時熒光定量PCR核酸擴增儀由兩部分組成：PCR系統和熒光檢測系統。熒光檢測系統主要包括激發光源和檢測器，現在的主流是多色多通道檢測，激發通道越多適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬。熒光檢測（二）熒光檢測系統

激發光源

檢測器

發光二極管

鹵鎢燈光源

超低溫CCD

光電倍增管實時熒光定量PCR核酸擴增儀金屬板式實時熒光定量PCR儀離心式實時熒光定量PCR儀各孔獨立控溫的定量PCR儀金屬板式實時熒光定量PCR儀即傳統的96孔板式定量PCR儀，由第三代的半導體PCR儀發展而來，在原位PCR儀的基礎上，增加熒光激發和檢測模塊，升級為熒光定量PCR儀。可作普通PCR儀使用，帶梯度功能，但溫度均一性差，有邊緣效應，標準曲線的反應條件難以做到與樣品完全一致。

金屬板式實時熒光定量PCR儀激發光源多為鹵鎢燈，與5色濾光鏡配合，可同時激發96或384個樣品；檢測器為超低溫CCD成像系統，可同時多點多色檢測，能有效分辨FAM／SYBRGreenI、VIC／JOE、NED／TAMRA／Cy3等多種熒光染料。隨機配制的定量PCR引物和探針設計軟件PrimerExpress可以設計定量PCR所需的TaqMan探針。有實時動態(Real-Time)和終點讀板(PlateRead)兩種模式。實時熒光定量PCR核酸擴增儀金屬板式實時熒光定量PCR儀離心式實時定量PCR儀

各孔獨立控溫的熒光定量PCR儀

離心式實時定量PCR儀離心式實時定量PCR儀器的樣品槽被設計為離心轉子的模樣，借助空氣加熱，轉子在腔內旋轉，每個樣品孔之間的溫度差異小于0.01℃，保障了標準曲線和樣品之間反應條件的一致性。激發光源大多采用發光二極管(LED)冷光源，運行前無需預熱，無需校正。系統誤差少，定量線性范圍可達l0個數量級。缺點：離心轉子小，可容納樣品量少，有的需用特殊毛細管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能。

離心式實時定量PCR儀Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀

LightCycleTM熒光定量PCR儀

離心式實時定量PCR儀LightCycleTM熒光定量PCR儀結構示意圖

實時熒光定量PCR核酸擴增儀金屬板式實時熒光定量PCR儀離心式實時定量PCR儀各孔獨立控溫的熒光定量PCR儀

各孔獨立控溫的熒光定量PCR儀各孔獨立控溫的定量PCR儀設計非常獨到，不同樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，各孔獨立控溫，可以在同一臺定量PCR儀上分進行不同條件的定量PCR反應，隨時利用空置的樣品槽開始其他定量反應，使用效率非常高。升降溫速度高達10℃／s，控溫精度高。每個模塊獨立控制的激發光源和檢測器直接與反應管壁接觸，保證熒光激發和檢測不受外界干擾。各孔獨立控溫的熒光定量PCR儀該類儀器整合多通道光學檢測系統，能有效分辨多種熒光染料，可對同一樣品進行多靶點分析，同時檢測四種熒光信號。可使用Taqman探針、分子信標、Amplifluor引物等多種檢測方法，定量線性范圍可達9個數量級。其軟件允許一臺儀器同時操作多個樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運用，還可實現任意梯度反應。缺點：上樣不如傳統方法方便，而且需要獨特的扁平反應管，使用成本較高。適合多指標快速檢測，但目前在國內應用尚少。第二節PCR擴增儀的分類與結構SmartCyclerⅡ熒光定量PCR儀第三節PCR核酸擴增儀的性能指標、操作規程

及常見故障的排除PCR核酸擴增儀的性能指標PCR核酸擴增儀的操作規程PCR核酸擴增儀常見故障的排除PCR核酸擴增儀的性能指標性能指標其他

軟件功能基座容量和樣品數熒光檢測

熒光檢測范圍檢測通道數量CT值重復性誤差溫度控制

溫度的均一性升降溫的速度不同模式下的相同溫度特性熱蓋溫度溫度的準確性溫度控制溫度的準確性是指樣品孔溫度與設定溫度的一致性，是PCR反應最重要的影響因素之一，直接關系到實驗的成敗。溫度的均一性是指樣品孔間的溫度差異，關系到不同樣品孔之間反應結果的一致性。如：“位置的邊緣效應”會影響結果的可重復性。升降溫的速度升降溫速度快，能縮短反應進行的時間，提高工作效率，提高PCR反應特異性。溫度控制升降溫的速度升降溫速度快，能縮短反應進行的時間，提高工作效率，提高PCR反應特異性。

熱蓋溫度熱蓋可使樣品管頂部溫度達到105℃左右，避免蒸發而改變PCR反應體積，無需再向反應管內添加石蠟油，減少了后續實驗的麻煩。

熒光檢測CT值重復性誤差

熒光檢測范圍

檢測通道數量

Ct值得重復性誤差Ct值得含義：每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系要求Ct值的CV小于或等于2.5%典型“S”型曲線指數起始期、擴增期、平臺期三期明顯Ct值的意義：擴增達到閾值時的循環數

Ct值與重復性同一樣本在相同條件下同時進行96次擴增FQ-PCRCt值與濃度不同的模板達到熒光域值時的Ct值不同熒光檢測范圍PCR是一個指數級擴增的過程，微量的起始拷貝數不同，經過幾十過循環后，其熒光差別將十分巨大。熒光檢測要求范圍：10-1010檢測的通道數量復合PCR實驗已成為一種流行趨勢，要求儀器具有多通道檢測能力。目前的PCR儀4通道檢測的居多，部分儀器具有6個檢測通道。其他

常用樣品管：0.2、0.5mlPCR管；8、12聯排管；96孔微孔板等

其他

新型的PCR儀都常規使用優質配套軟件，此類軟件易學易用，還具有實時信息顯示、記憶存儲多個程序，及自動倒計時、自動斷電保護等功能，很多儀器還可以免費升級。第三節

PCR擴增儀的性能指標

PCR擴增儀的操作規程

PCR擴增儀的常見故障的排除PCR核酸擴增儀的操作規程普通PCR擴增儀的操作非常簡便，接通電源，儀器自檢，按照程序設置溫度或調出儲存的程序運行即可。定量PCR擴增儀的操作和普通PCR儀基本相同。第三節

PCR擴增儀的性能指標

PCR擴增儀的操作規程

PCR擴增儀的常見故障的排除PCR核酸擴增儀常見故障的排除熒光染料污染樣品孔：請工程師清潔樣品孔；PCR管融化：可能是溫度傳感器出問題或是熱蓋出問題，需工程師檢修；個別孔擴增效率差異很大：可能的原因是半導體模塊出現壞點，需工程師檢修；PCR核酸擴增儀常見故障的排除熒光強度減弱或不穩定：原因有濾光片發霉或有水汽等，需工程師檢修；或光源損耗需更換光源；或需調節檢測元件靈敏度，也需工程師調試；儀器工作時出現噪聲：可能的原因是PCR管沒有放好；或風扇松動，需工程師檢修；PCR核酸擴增儀常見故障的排除儀器采集熒光時有不正常的噪聲：某些光纖傳導信號的定量PCR儀可能出現這一問題，需工程師檢修或更換配件；機器搬動后不能正常工作或不能正常采集熒光信號對于某些光路系統復雜的儀器，應盡量避免自行搬動儀器。出現這種情況后需工程師重新調試;PCR反應假陰性原因很多，其中PCR儀控溫不準也是一個重要原因，可使用電子測溫儀校準溫度