?通過改變溶液條件，使溶質以固體形式從溶液中分出的操作技術。?鹽析法?有機溶劑沉淀法?等電點沉淀法?結晶法當前1頁，總共57頁。第一節鹽析法(saltprecipitation)定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。優點：簡單、經濟、較少變性缺點：分辨率不高，要除鹽當前2頁，總共57頁。兩種現象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強度的增高，蛋白質溶解度增大鹽析：高鹽，鹽離子強度增加，蛋白質溶解度減小當前3頁，總共57頁。一、基本原理當前4頁，總共57頁。原理?形成離子對，部分中和了蛋白質的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。?中性鹽的親水性比蛋白質大，使蛋白質脫去了水化膜，使其沉淀。當前5頁，總共57頁。在鹽析區，符合公式logS=β-KsμS——蛋白質溶解度，g/L；μ—鹽離子強度,Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價；β——常數,為縱坐標上的截距;Ks——鹽析常數。當前6頁，總共57頁。β、KS?β為縱坐標上的截距，是外推截距，與無機鹽種類無關。?KS是鹽析常數，與蛋白質和鹽的種類有關，但與溫度和pH無關。?兩種類型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強度（鹽濃度）進行鹽析，稱作KS鹽析法。（2）在一定離子強度下僅改變pH和溫度進行鹽析，稱作β鹽析法。當前7頁，總共57頁。二、影響鹽析的因素（一）、無機鹽的種類鹽析能力：半徑小的高價離子在鹽析時的作用較強，陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以高價陰離子更為明顯。PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―NH4+＞K+＞Na+＞Li+鹽析用鹽要考慮幾個因素：常用硫酸銨當前8頁，總共57頁。(二）溶質（蛋白質等）種類的影響當前9頁，總共57頁。鹽析分布曲線當前10頁，總共57頁。（三）蛋白質濃度的影響?蛋白質濃度提高，鹽用量減少當前11頁，總共57頁。（四）溫度的影響?溫度的變化會影響β值。?在無鹽或稀鹽溶液中，大多數蛋白質溶解度是隨溫度升高而增大的，但在高鹽溶液中常相反。當前12頁，總共57頁。（五）pH的影響?當溶液的pH在蛋白質等電點附近時，β值最小。?利用β值最低點時pH的不同，可以分級沉淀蛋白質.當前13頁，總共57頁。三、鹽析操作（一）鹽析用鹽的濃度表示固體粉末硫酸銨飽和溶液常用“飽和度”來表征硫酸銨在溶液中的最終濃度，25℃時(NH4)2SO4的飽和濃度為4.1mol／L，定義它為100%飽和度.當前14頁，總共57頁。當前15頁，總共57頁。（二）鹽析方法和注意事項1、分部鹽析法2、重復鹽析法3、反抽提法一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀。將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。當前16頁，總共57頁。分部鹽析法當前17頁，總共57頁。反抽提法(RNA聚合酶)當前18頁，總共57頁。注意事項?“局部過濃”?溫度（室溫）?分離方法當前19頁，總共57頁。第二節有機溶劑沉淀

(OrganicSolventPrecipitation)

?定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。當前20頁，總共57頁。一、基本原理1、降低了介質的介電常數，使溶質分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。2、水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導致脫水凝集。當前21頁，總共57頁。一些溶劑的介電常數當前22頁，總共57頁。?優點：乙醇等有機溶劑易除去，產品更純凈；密度差較大，離心收集。?缺點：容易使蛋白質變性，操作常需低溫，成本高，需防火防爆當前23頁，總共57頁。二、影響沉淀效果的因素（一）有機溶劑種類及用量常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。（二）pH的影響許多蛋白質在等電點附近時溶解度最低，溶液pH應在等電點附近，還須考慮蛋白質的穩定性。當前24頁，總共57頁。（三）溫度（低溫沉淀）

有機溶劑存在下，大多數蛋白質的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。（四）無機鹽的含量低鹽：有利于沉淀，還有保護蛋白質，防止變性。高鹽：增大蛋白質在有機溶劑―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。當前25頁，總共57頁。（五）某些金屬離子的助沉淀作用

多價陽離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質結合形成復合物，使蛋白質溶解度降低。胰島素精制：當前26頁，總共57頁。（六）樣品濃度濃度小時，增加溶劑投入量和損耗。濃度大時，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白質濃度0.5%～2%；粘多糖濃度1%～2%。當前27頁，總共57頁。第三節其它沉淀方法一、等電點沉淀法對于兩性物質，等電點時凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，發生沉淀。雜蛋白當前28頁，總共57頁。胰島素純化：

胰島素?pH8?除去堿性雜蛋白?pH3?除去酸性雜蛋白當前29頁，總共57頁。二、成鹽沉淀法金屬離子沉淀：與生物分子的酸性功能團作用的金屬復合鹽法；有機酸類復合鹽沉淀:與生物分子的堿性功能團作用的有機酸復合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等）。當前30頁，總共57頁。1．金屬離子沉淀：

Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；2．生成有機酸類復合鹽沉淀（1）丹寧即鞣酸（2）雷凡諾（3）三氯乙酸（TCA）當前31頁，總共57頁。當前32頁，總共57頁。當前33頁，總共57頁。三、親和沉淀利用親和反應原理，將配基與可溶性的載體偶聯后形成載體-配基復合物（親和沉淀劑），該復合物可選擇性地與蛋白質結合，在一定條件下沉淀出來。中性可溶，酸性沉淀。當前34頁，總共57頁。當前35頁，總共57頁。四、高分子聚合物沉淀水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質水合作用減弱而發生沉淀。五、表面活性劑十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）酸性多糖當前36頁，總共57頁。當前37頁，總共57頁。六、選擇性變性沉淀法?熱變性沉淀法?酸堿變性沉淀法?利用試劑（氯仿）當前38頁，總共57頁。固相析出分離法?第一節鹽析法?第二節有機溶劑沉淀?第三節其它沉淀方法

一、等電點沉淀法二、成鹽沉淀法當前39頁，總共57頁。第四節結晶(crystallization)?定義：溶液中的溶質在一定條件下因分子有規則的排列而結合成晶體。?通過結晶，溶液中的大部分雜質會留在母液中，經過濾、洗滌可得到純度高的晶體。當前40頁，總共57頁。一、結晶過程指溶質自動從過飽和溶液中析出形成新相的過程。C2—小晶體的溶解度；C1—普通晶體的溶解度；ρ—晶體密度；M—晶體質量；σ—晶體與溶液間的界面張力；γ2—小晶體的半徑；γ1—普通晶體的半徑；當前41頁，總共57頁。結晶包括三個過程：(1)形成過飽和溶液;(2)晶核形成;(3)晶體生長。當前42頁，總共57頁。濃度溫度圖當前43頁，總共57頁。二、過飽和溶液的形成(結晶方法)（一）、蒸發法（二）、溫度誘導法熱盒技術（三）、鹽析結晶法（四）、透析結晶法（五）、有機溶劑結晶法當前44頁，總共57頁。溫度誘導法當前45頁，總共57頁。鹽析結晶法當前46頁，總共57頁。透析結晶法當前47頁，總共57頁。（六）、等電點法（七）、微量擴散法（八）、化學反應結晶法調節溶液的pH或向溶液中加入反應劑，成新物質，結晶析出。（九）、共沸蒸餾結晶當前48頁，總共57頁。等電點法當前49頁，總共57頁。化學反應結晶法當前50頁，總共57頁。綜合利用當前51頁，總共57頁。三、提高晶體質量的途徑工業上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌。（一）、晶體大小影響晶體大小的主要因素有過飽和度、溫度、攪拌速度、晶種等。當前52頁，總共57頁。晶種當前53頁，總共57頁。（二）、晶體形狀改變晶體外形，可用:選擇不同的溶劑、控制過飽和度、結晶溫度、調節溶液的pH和有目的地加入某種能改變晶形的雜質等。（三）、晶體純度晶體表面具有一定的物理吸附能力。重結晶：即將晶體用合適的溶劑溶解再次結晶。當前54頁，總共57頁。重結晶(recrystallization)?溶解度受溫度影響較大的物質，將產品溶解在熱的溶劑中，緩慢降低溫度析出晶體。?將溶質溶于一種溶劑中，然后將第二種溶劑加熱后緩緩地加入，放置一段時間使結晶完全。當前55頁，總共57頁。紅霉素重結晶用于生物物質重結晶的溶劑一般有蒸餾水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低級醇等。當前56頁，總共57頁。第五章1、鹽析沉淀是利用各種生物分子