發根農桿菌的學習教案第1頁/共22頁與根癌農桿菌相比，發根農桿菌在植物遺傳轉化方面具有明顯的優越性。用Ti質粒作為基因載體時．由于Ti質粒T-DNA區的癌基因經常造成被轉化的植物組織形成腫瘤，阻礙正常植物的再生，為了防止腫瘤的形成，常采用除去Ti質粒T—DNA區癌基因的方法，即“解除武裝”，而用Ri質粒作為基因載體時，不需要“解除武裝”，從其轉化的植物細胞上很容易再生出植株；Ti質粒轉化植物產生的瘤組織有可能是一個轉化細胞與非轉化細胞所構成的嵌合體，而發根農桿菌轉化植物產生的毛根來源于同一個植物細胞，因此，毛根的每一個細胞都是轉化的；第2頁/共22頁毛根的無性系可以通過激素的自主性進行選擇；

Ri質粒轉化植物所產生的毛狀根分化為正常植株的分化率高，倍性穩定，并且容易建成一系列能夠在不同植物細胞核染色體上插入一個T-DNA拷貝的株系。毛狀根具有生長迅速、多分支、數量大、沒有向地性，擁有親本植物的特征次級代謝途徑，能形成有價值的次生代謝產物等特點。由毛狀根再生的植株經常表現出節間短、頂端優勢比較弱、葉皺等特殊特征，這對于植物轉化體的篩選非常有利。第3頁/共22頁第4頁/共22頁發根農桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細菌，它能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物以及個別裸子植物。Ri質粒為根誘導質粒(RootInducingPlasmid)；Ri質粒的大小為200～800kb，它含有負責發根自主性生長和冠癭堿合成的基因，在結構上有致毒區(Vir區)，轉移進入植物細胞核的T-DNA區及其內部的冠癭堿合成功能區等。根據其合成冠癭堿的不同，可將Ri質粒分為4種類型：①甘露堿型(MannopineType)，合成甘露堿及其酸、農桿堿酸與農桿堿素A；②黃瓜堿型(CucumopinType)，合成黃瓜堿；③農桿堿型(AgropineType)，合成農桿堿及其酸、甘露堿及其酸、農桿堿素A；④米奇矛型(MikimopineType)Petit等發現含農桿堿型Ri質粒的發根農桿菌較甘露堿型、黃瓜堿型和米奇矛型有更為廣泛的宿主范圍。第5頁/共22頁Ri質粒第6頁/共22頁第7頁/共22頁Ri質粒通過T-DNA轉移到被侵染植物中，使其生成毛狀根。農桿堿型Ri質粒上的T-DNA呈不連續分布，TR-DNA及TL-DNA上的基因與毛狀根的形成有關，同時也影響著再生植株地上部分形態和一些生理性狀。TR-DNA的基因tmsl和tms2能指導IAA的合成，因此轉化生成毛狀根在培養時不需要添加生長激素。所有Ri質粒Vir區的保守性很高，在轉化過程中，Vir區上的基因不發生轉移，但它對T-DNA的轉移起著極為重要的作用；在通常狀態下，Vir區的基因處于抑制狀態，當發根農桿菌感染植物時，受損傷植物合成乙酰丁香酮，使Vir區抑制狀態的基因被激活，產生限制性核酸內切酶，在酶的作用下產生T-DNA鏈，并引導T-DNA鏈與細菌細胞膜上的特定部位結合，然后向植物細胞轉移，進入植物細胞核內，T-DNA隨后整合進入植物細胞基因組。第8頁/共22頁發根農桿菌感染植物的方法發根農桿菌誘導植物毛狀根生成的方法主要有以下3種：植物體直接接種法在植物無菌苗、莖桿上劃出傷口，將發根農桿菌接種在傷口處，培養一段時間后，在接種部位產生毛狀根。外植體接種法取植物的無菌外植體，與發根農桿菌共同培養，在選擇培養基上進行繼代培養，發根農桿菌被殺死，轉化細胞產生愈傷組織，并誘導生成毛狀根。原生質體共培養法將愈傷組織制備成原生質體，與發根農桿菌共同培養，在含抗生素的選擇培養基上對轉化細胞進行篩選，得到轉化克隆，再在分化培養基上得到完整的植株。第9頁/共22頁發根的鑒定形態學水平：激素自養，根叢生，多分枝，多根毛，無向地性組織水平：GUS活性的測定或NPTII酶的檢測細胞水平：冠癭堿的測定分子水平：SouthernBlot,PCR等方法第10頁/共22頁發根農桿菌1.1菌株類型目前采用的發根農桿菌主要有天然農桿堿型的A4、ATCCl5834、16834、LBA9402及1601、R1000、R1200等人工構造質粒；還有黃瓜堿型的2635、2657、2659等；以及甘露堿型的5196、TRl01、TR7等，每一種菌株對不同植物的發根能力是不同的。1.2菌液濃度一般菌種濃度過大，細菌生長迅速，一定程度上抑制細胞代謝過程，且不易除菌；濃度太稀，能附著在細胞的細菌太少，不足以形成足夠的毛狀根。影響發根農桿菌轉化的因素第11頁/共22頁植物及其外植體2.1植物種類目前轉化成功的植物主要是草本植物，尤以雙子葉植物為多，也有為數不多的單子葉植物(如栝樓、旱墨蓮、露水草)和少數木本植物(如銀杏)等誘導成功。2.2外植體類型已成功誘導出毛狀根的植物外植體有葉片，莖、子葉、愈傷組織、下胚軸等多種，但不同的外植體發狀根的誘導率不同。究竟植物的哪一部分器官最適合用于轉化，并無嚴格的規律可循，但一般采用的都是較幼嫩的組織，因為這些細胞處于旺盛的分裂狀態，容易接受外源DNA。第12頁/共22頁2.3外植體預培養以及浸染和共培養時間外植體產生傷口后在愈合過程中會形成乙酰丁香酮等物質并釋放出來作為誘導發根農桿菌識別的信號分子，因此發根農桿菌侵染前要經過一定時間預培養，使受體能形成并釋放這種信號分子，提高轉化率。同時經農桿菌感染的外植體傷口處細胞因為過敏反應而可能導致褐化，嚴重影響根的形成及轉化效率．預培養也能較好的解決褐化問題。用煙草葉片在菌液中分別浸泡1，5，10、30、60rain后進行轉化，結果表明5rnin可達到較高轉化率，時間過長超過30min葉片死亡率上升。轉化后葉片共培養1～4d有不同的轉化率，共培養2d轉化率最高，過早的結束共培養，轉入抗生素雖可抑制菌的增殖，但也明顯降低了發根誘導率，共培養時間過長，由于農桿菌過量增殖而致使葉片組織死亡率升高，而且增加了除菌的難度，轉化率也大幅下降。2.4外植體放置方向可能與葉片上下表皮細胞生理結構不同、分泌次生物質能力存在差異等有關。第13頁/共22頁化學因子3.1培養基一般而言，高鹽培養基如MS、LS等有助于毛狀根的形成；而低鹽培養基如B5等則有助于細菌增殖，在毛狀根形成后的除菌過程中，除菌比較困難。3.2外源激素在發狀根的誘導過程中，添加適當濃度的外源激素對于提高發狀根的誘導頻率有明顯的促進作用。3.3酚類物質植物受傷后產生的酚類物質能激活vir基因，促使Ri質粒向植物細胞轉移，在轉化系統中加入某種酚類物質可以促進基因轉化。目前廣泛使用的是AS、羥基乙酰丁香酮(OH-AS)和香草酚等酚類物質。添加適量AS能顯著提高發狀根的轉化效率，但是過量的As對外植體有毒害作用，影響轉化效果。3.4碳水化合物發根農桿菌Ri質粒的rolC生根基因的啟動子活性受蔗糖濃度的調節，糖類物質可以協助乙酰丁香酮等物質誘導產生高水平的vir區基因表達，從而提高轉化率。第14頁/共22頁物理因子4.1光照強度4.2溫度4.3pH值在農桿菌與植物細胞進行共培養時，使用較低pH的培養基有利于轉化頻率的提高。原因可能是在偏酸的培養條件下，有利于農桿菌Vir區基因的表達，但較低pH條件下，培養基的凝固狀態較差．不利于試驗操作，容易污染。4.4超聲波、微波和真空滲透處理真空滲透處理在植物材料表面產生很多微損傷，抽真空后形成的負壓使農桿菌更緊密地吸附于外植體傷口及傷口內細胞間隙，促進T-DNA向植物細胞的導入。超聲波處理也可在外植體上產生許多微小傷口，從而提高農桿菌與外植體之間的接觸面積，提高轉化頻率。短暫微波輻射產生的熱效應也有助于農桿菌T-DNA向植物細胞的導入。第15頁/共22頁4.5甘露醇預處理高滲處理可有效提高轉化率。這可能是由于一定濃度的甘露醇使細胞處于滲透脅迫條件下發生質壁分離和輕微細胞傷害，而這種受傷狀態有利于農桿菌向受體細胞的附著和T-DNA通過合成如脯氨酸類滲透調節物向植物細胞的轉移和整合。但是甘露醇濃度過高(>0.75mol／L)和處理時間過長(24h)則可能使細胞處于高滲環境形成不可逆受傷狀態，轉化率反而降低。第16頁/共22頁毛狀根的應用用毛狀根生產次生代謝產物利用發根農桿菌進行次生代謝物質生產，具有許多適應工業化生產的特點，如無需添加外源生長素、迅速自主生長、遺傳穩定性高、能合成植物特有的次生代謝物，而且其含量往往比植物自身合成的含量還高。第17頁/共22頁第18頁/共22頁第19頁/共22頁毛狀根培養技術在理論研究中的應用由于發根農桿菌誘導生成的毛狀根生長迅速、條件可控且遺傳穩定性高，因而生成的毛狀根是進行許多與根相關的理論研究的理想試驗系統。另外，發根農桿菌轉基因獲得的毛狀根也可以作為研究作物根部寄生病蟲害病理的良好材料。第20頁/共22頁毛狀根再生獲得轉基因植物和培育作物新品種