課題1微生物的實驗室培養1專題2微生物的培養與應用微生物作畫1主要內容：1.微生物的種類和微生物的營養需求；2.培養基的類型和用途；3.無菌技術操作，區分消毒和滅菌。

掌握微生物相關的基礎知識，區分培養基的種類是后續知識學習的關鍵。認真理解選擇培養基和鑒別培養基、消毒和滅菌的區別以及各自的不同類型舉例。2一、微生物的類群特點：結構都相當簡單，個體多數十分微小。通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構。34擬核，大型環狀DNA質粒(含抗生素抗藥性，固氮基因)其成分為肽聚糖有的細菌會形成芽孢芽孢----細菌的休眠體，對惡劣的環境有抵抗力藍藻、硝化細菌等細菌的營養異養型自養型寄生腐生5芽孢

有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發，形成一個細菌。休眠體，而非繁殖體6菌落：

P18在固體培養基上由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據。形狀、大小、隆起度、顏色等方面為區分依據。7二、培養基：培養基（培養液）是按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。1、概念：2、營養成份：（生長因子）營養成份：水、碳源、氮源、無機鹽其它：特殊營養需求

條件：ＰＨ、、氧氣8微生物需要的營養物質及功能a.碳源b.氮源c.生長因子（特殊營養物質）d.無機鹽e.水凡是能為微生物提供所需碳元素的營養物質。①無機碳源：CO2；NaHCO3等②有機碳源：糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等①構成細胞物質和一些代謝產物②異養微生物的能源⑴.概念：⑵.來源：⑶.作用：1.微生物的碳源9①無機氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。②有機氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能夠為微生物提供N元素的營養物質。主要用于合成蛋白質、核酸及含N的代謝產物。2.微生物的氮源⑴.概念：⑵.來源：⑶.作用：微生物生長不可缺少的微量有機物。3.生長因子⑶.常見生長因子：⑴.概念：⑵.作用：酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。10特別注意：培養乳酸桿菌時需要在培養基添加維生素；培養霉菌時需將pH調至酸性，培養細菌時需要將pH調至中性或微堿性；培養厭氧微生物時需要提供無氧的條件。111．關于微生物營養物質的敘述中，正確的是（）A、是碳源的物質不可能同時是氮源B、凡碳源都提供能量C、除水以外的無機物只提供無機鹽D、無機氮源也能提供能量DNH3能為硝化細菌提供能量122．右表某微生物培養基成分，回答：（1）右表培養基可培養的微生物類型是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養基中。如不想浪費此培養基，可再加入

,培養金黃色葡萄球菌。（3）若除去成分②，加（CH2O），該培養基可用于培養

。（4）表中營養成分共有

類。（5）不論何種培養基，在各種成分都溶化后分裝前，要進行是

。（6）右表中各成分重量確定的原則是

。（7）若右表培養基用于菌種鑒定，應該增加的成分是

。自養型微生物

含碳有機物

固氮微生物

3

調整pH

依微生物的生長需要確定

瓊脂（或凝固劑）133、培養基的類型和用途144.常見的選擇培養基---微生物的分離分離酵母菌、霉菌等真菌（加入青霉素的培養基）分離金黃色葡萄球菌（加入高濃度食鹽的培養基）分離固氮微生物（不加氮源的無氮培養基）分離自養型微生物（不加含碳有機物的無碳培養基）分離導入了目的基因的受體細胞

（加入青霉素等抗生素的培養基）④當培養基的某種營養成分為特定化學成分時，也具有分離效果。如石油是唯一碳源時，可以抑制不能利用石油的微生物的生長，使能夠利用石油的微生物生存，從而達到分離能消除石油污染的微生物的目的。⑤改變微生物的培養條件，也可以達到分離微生物的目的，如將培養基放在高溫環境中培養，則只能得到耐高溫的微生物。155.常見的鑒別培養基---微生物的鑒定1、伊紅--美藍培養基常用于鑒別大腸桿菌，出現黑色菌落；2、在以尿素為唯一氮源的培養基中加酚紅指示劑，指示劑變紅，用來鑒別能分解尿素的細菌；3、剛果紅與纖維素等多糖類物質反應形成紅色復合物，添加剛果紅的培養基呈紅色，接種的微生物若能夠分解纖維素，就會在其菌落的周圍形成透明圈。

16三.無菌技術操作

無菌操作泛指在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。獲得純凈培養物的關鍵是：防止外來雜菌入侵。17（一）.微生物實驗室培養的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養基的配制3、培養基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養7、菌種的保存18(二).消毒與滅菌1920

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養基的營養成分不被破壞。

有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。

而培養皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設計的。

21煮沸消毒法巴氏消毒法化學藥劑（70%酒精等）紫外線消毒針對不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺能耐高溫的，需要保持干燥的物品灼燒法干熱滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具（接種環等）吸管實驗操作者的雙手培養皿等玻璃器皿培養基1、消毒方法2、滅菌方法干熱滅菌221.無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養細菌用的培養基與培養皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。課本問題回答：233、如下表所示為某微生物培養基的配方，請回答：（1）依物理性質劃分，該培養基屬于

培養基；依用途劃分，則屬于

培養基。（2）根據培養基的原料，所培養微生物的同化作用的類型是

，培養的微生物可能是

。（3）該培養基中的碳源是

。不論何種培養基，在各成分都溶化后分裝前，要進行的是

和

，倒平板時，一般需冷卻至

左右，在

附近操作。

選擇

液體酵母菌或霉菌異養型酒精燈火焰（CH2O）調整pH滅菌50℃243、如下表所示為某微生物培養基的配方，請回答：（4）若用該培養液培養纖維素分解菌，應除去的物質是

，應加入的物質是

，為檢測纖維素分解菌的存在與否還應加入

，形成

色復合物，若產生

，則證明有纖維素分解菌存在。青霉素和（CH2O）透明圈纖維素粉剛果紅紅

254.近期網絡上流行一種利用制作酸奶來判斷牛奶好壞的方法，以下自制酸奶的方法：①將牛奶倒入玻璃杯，放在沸水中加熱10min。②降溫到42℃，每杯牛奶加入0.15g酸奶發酵劑。③用干凈小勺攪拌均勻，在杯子外封上保鮮膜。④在42℃下保溫5h后，放在4℃冰箱中冷藏1h?；卮穑?1)牛奶在沸水中加熱10min，屬于_____(填“消毒”或“滅菌”)的方式，你推測酸奶發酵劑中含有的成分是________，第②步降溫到42℃的目的是_____________，第③步封上保鮮膜的目的是_________________________。乳酸菌避免高溫使菌種失活避免雜菌污染，構建無氧環境消毒還不能殺死芽孢自制酸奶的方法：①將牛奶倒入玻璃杯，放在沸水中加熱10min。②降溫到42℃，每杯牛奶加入0.15g酸奶發酵劑。③用干凈小勺攪拌均勻，在杯子外封上保鮮膜。④在42℃下保溫5h后，放在4℃冰箱中冷藏1h。(2)除了沸水中加熱10min外，本過程中還有哪些操作避免了酸奶被雜菌污染？其原理是什么？(寫出兩條即可)①操作：________________，原理：_______________________________________。②操作：________________，原理：_______________________________________。(3)酸奶中的多種活菌對健康有益，若要檢測不同酸奶中各種有益菌的數量是否達標，可采用

法。加入酸奶發酵劑迅速使乳酸菌形成優勢種群，抑制雜菌生長封上保鮮膜避免雜菌污染，并抑制需氧雜菌生長③操作：________________，原理：_______________________________________。④操作：________________，原理：_______________________________________。42℃下保溫5h乳酸菌的最適溫度，其他雜菌在此溫度下競爭力弱用干凈的小勺防止小勺帶入過多雜菌稀釋涂布平板要計數才知道是否達標。知識復習：微生物培養技術中的消毒和滅菌

微生物的純化培養

自然環境中，微生物混在一起生長，要想純化培養，首先要將單個細胞與其他細胞分離開，進而培養成肉眼可見的子細胞群體---菌落。

包括培養基的制備和純化微生物兩個階段，純化微生物時常用的接種方法是平板劃線法和稀釋涂布平板法。1.制備牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏蛋白胨固體培養基配方牛肉膏

5.0g

主要提供碳源、氮源、磷酸鹽和維生素

蛋白胨

10.0g

主要提供碳源、氮源和維生素

NaCl

5.0g提供無機鹽

瓊脂

20.0g

固體培養基凝固劑

水

定容至1000mL

氫元素、氧元素

牛肉膏為瘦牛肉浸出汁濃縮而成的膏狀物質，富含水溶性糖類、有機氮化合物、維生素、鹽等。

蛋白胨是將肉酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成，富含有機氮化合物，也含一些維生素和糖類。2.培養基配制的操作步驟：制備牛肉膏蛋白胨培養基(用于培養細菌)計算稱量溶化原料和瓊脂調pH至中性或微堿性滅菌擱置斜面倒平板（1）溶化時為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中，減少誤差。（2）加瓊脂的目的是什么?作為凝固劑3.倒平板1.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？答：可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基?；卮饐栴}：4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？答：不能，空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以避免皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染；又可以避免培養基培養基中水分過快的揮發。主要內容：

1.掌握平板劃線法和稀釋涂布平板法基本操作技術2.菌種的保藏

菌種純化過程采用以平板劃線法和稀釋涂布平板法為主進行分離，認真理解操作過程中的每一個步驟，知道為什么這樣操作；理解菌種保藏的兩種方法。1、接種最常用方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法（二）純化大腸桿菌（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養基三、純化大腸桿菌

將接種后的培養基和一個未接種的培養基放入37℃恒溫箱中培養12h和24h后，觀察并記錄2、平板劃線法3、稀釋涂布平板法（1）系列稀釋操作（2）涂布平板操作微生物的接種技術還包括斜面接種、穿刺接種等方法。核心都是要防止雜菌的污染，保證培養物的純度。看課本理解一遍，再填空：火焰冷卻三至五末端燒紅

倒置平板劃線法：平板劃線的操作方法平板劃線接種的步驟和說明答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者?；卮穑?.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？2.在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。系列稀釋操作

應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。①菌落較均勻②涂布器③計數①菌落分布密集到單個②劃線③接種環④相對較簡單的接種方式⑤挑起四、菌種的保藏1.臨時保藏

斜面保藏:首先，將菌種接種到試管的固體斜面培養基上，在合適溫度下培養。當菌落長成后，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3-6個月，都要重新將菌種從舊的培養基上轉移到新的培養基上。但是，這種方法保存時間不長，菌種容易被污染或產生變異。2.長期保藏

甘油管藏：在3mL的甘油瓶中，裝入1mL的甘油后滅菌，將1mL培養的菌液轉移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的冷凍箱中保藏。四、課題成果評價（一）培養基的制作是否合格

如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養基上出現了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄

培養12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發現這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養學生良好的科學態度與習慣。本課題知識小結:5.根據你所學的知識，回答下列問題。（1）若培養芽孢菌，配制固體培養基的基本步驟是：

稱量→溶化→______→____________

→加棉塞→包扎。（2）若檢驗自來水中的大腸桿菌是否超標，需在培養基中加入___________；若將農田土壤表層中的圓褐固氮菌與其他細菌分離出來，則需要在______的培養基上培養。按照培養基的用途劃分，前者屬于_____培養基，后者屬于____

培養基。（3）右表是木屑培養基各成分所占比例：

此培養基加水后可用于培養平菇。按物理性質分，屬于

培養基，用簡易的方法對培養基進行滅菌時，要重復2～3次，其主要目的是有利于徹底殺滅萌發的___

。(培養基的)分裝調pH芽孢伊紅一美藍無氮鑒別選擇固體6.某學校對食用菌實驗室進行清掃和消毒處理，準備食用菌栽培所需的各種原料和用具，然后從菌種站購來各種食用菌菌種。（1）對買回來的菌種進行擴大培養，首先制備試管培養基，寫出制備固體牛肉膏蛋白胨培養基所需原料：

、

、

、

、

。其中提供氮源是

；提供能源的主要物質是

。（2）微生物在生長過程中對各種成分所需量不同，配制培養基時各成分要有合適的

。在燒杯中加入瓊脂后要不停地

，防止

。（3）將配制好的培養基分裝到試管中，加棉塞后若干個試管一捆，包上牛皮紙并用皮筋勒緊放入

中滅菌，壓力

kPa，溫度

，時間

。牛肉膏蛋白胨

蛋白胨水無機鹽瓊脂蛋白胨、牛肉膏攪拌瓊脂糊底引起燒杯破裂比例高壓蒸汽滅菌鍋121℃10015～30min6.某學校對食用菌實驗室進行清掃和消毒處理，準備食用菌栽培所需的各種原料和用具，然后從菌種站購來各種食用菌菌種。滅菌完畢后拔掉電源，待鍋內壓力自然降到0時，將試管取出。如果棉塞上沾有培養基，此試管應

。（4）使用高壓蒸汽滅菌鍋時注意，先向鍋內倒入

，把鍋內水加熱煮沸并將其中原有冷空氣徹底排出后將鍋密閉。（5）從一支試管向另一支試管接種時，接種環要用酒精燈

（“內”或“外”）焰滅菌，并且待接種環

后蘸取菌種，試管口不能離開酒精燈火焰附近，將接種的試管放入

℃冰箱中保藏。廢棄

4適量水外冷卻

7.(15分)請回答下列與大腸桿菌有關的問題：(1)從生態系統的成分上看，大腸桿菌屬于

；它的同化作用類型是

。(2)下表是某公司研發的一種培養大腸桿菌菌群的培養基配方。根據用途劃分該培養基屬于______培養基。該培養基中的碳源是________

。(3)培養大腸桿菌時，常用的接種方法是平板劃線法和________

。為防止雜菌污染需要對培養基和培養皿進行________。異養型分解者乳糖、蔗糖(蛋白胨)

鑒別滅菌稀釋涂布平板法7.(15分)請回答下列與大腸桿菌有關的問題：(4)現有一升水樣，用無菌吸管吸取1mL水樣至盛有9mL無菌水的試管中，依次稀釋103稀釋度。各取0.1mL已稀釋103倍的水樣分別接種到三個培養基上培養，記錄的菌落數分別為55、56、57，則每升原水樣中大腸桿菌數為__

_。(5)以下微生物發酵生產特定產物時，所利用主要微生物的細胞結構與大腸桿菌相同的是(多選)________。A．制作果酒B．由果酒制作果醋C．制作泡菜D．制作腐乳(6)利用培養基不僅可以分離培養微生物，也可以進行植物組織培養。與微生物培養明顯不同的是，用于組織培養的培養基中還需要加入______

。

BC

5.6×108植物激素(或生長素和細胞分裂素)8.下表為牛肉膏、蛋白胨培養基的成分列表，據此回答：⑴蛋白胨在培養基中的作用是提供

、

等營養物質。⑵要用此材料配制觀察細菌菌落狀況的培養基，還需添加的成分是

。⑶表中各成分含量確定的原則是

。⑷培養基配制好后，分裝前應進行的工作是

。⑸接種時，所采用的預防雜菌感染的方法是

、

。⑹在培養基凝固前要擱置斜面，其目的是

。瓊脂（凝固劑）碳源

氮源、生長因子

所培養微生物對各營養成分的需要量

調整pH

在火焰旁接種

燒灼接種環增大接種面積8.如右圖是微生物平板劃線示意圖。劃線的順序為12345。下列操作方法正確的是(

)A．操作前要將接種環放在火焰邊灼燒滅菌

B．劃線操作須在火焰上進行

C．在5區域中才可以得到所需菌落

D．在12345區域中劃線前后都要對接種環滅菌D火焰外焰火焰旁最可能獲得單菌落使細菌數目隨劃線次數增加而逐步減少，最終獲得單菌落。10.在培養基的配制過程中，具有如下步驟：①溶化②調pH③加棉塞④包扎⑤分裝⑥稱量正確的順序為

；⑥①②⑤③④9.制備牛肉膏蛋白胨固體培養基，倒平板時，需要等待平板冷卻

后，將平板倒過來放置。微生物接種的方法，最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法,后者是將菌液進行一系列的

，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。菌落是在固體培養基上由

細胞繁殖而來的形態可見的子細胞群體。單個（1分）

凝固（2分）梯度稀釋（2分）11.根據有關微生物的知識，分析回答問題：(1)當水體過于純凈時，硝化細菌會形成休眠體，這種休眠體被稱為________。(2)對于混有硝化細菌、藍細菌和大腸桿菌的懸浮液，可利用選擇培養基進行微生物篩選。篩選硝化細菌的培養基成分包括________(供選：①葡萄糖、②纖維素、③牛肉膏、④(NH4)2SO4、⑤KNO3、⑥無機鹽、⑦瓊脂、⑧伊紅美藍染料、⑨H2O)，制備培養基時，滅菌與調pH的先后順序是_______________。(3)如利用上述培養基篩選大腸桿菌菌落，則應另外添加的成分是______________________，菌落特征為_________。④⑥⑦⑨芽孢呈現黑色先調pH再滅菌葡萄糖、伊紅美藍染料11.根據有關微生物的知識，分析回答問題：(4)將采自養殖池中的水樣1mL稀釋100倍，然后吸取稀釋后的水樣1mL，接種于上述硝化細菌選擇培養基上培養，接種所使用的工具是________。一段時間后觀察菌落并計數，實驗重復三次結果如圖所示。該養殖池每毫升水含有硝化細菌______個。涂布器80012.微生物培養與分離技術是生物學中重要的實驗技術。根據有關微生物的知識，分析回答問題：（1）培養基的制備需經過計算、稱量、溶化和B：

、A：

等過程，上述過程中需要在超凈工作臺上操作的是

。（2）純化菌種時為得到單菌落，常采用的接種方法是平板劃線法和D：

法，其中需用接種環進行操作的是

；可以進行菌體計數的是

。平板劃線法倒平板滅菌倒平板稀釋涂布平板稀釋涂布平板13.（14新課標Ⅱ）為了調查某河流的水質狀況，某研究小組測定了該河流水樣中的細菌含量，并進行了細菌的分離等工作。回答：（1）該小組采用稀釋涂布平板法檢測水樣中的細菌含量。在涂布接種前，隨機取若干滅菌后的空平板先行培養了一段時間，這樣做的目的是

；然后，將1mL水樣稀釋100