質粒DNA的限制性內切酶酶切及其鑒定［實驗目的］訓練學生正確使用加樣器；了解限制性內切酶及酶切條；學會分析質粒DNA的酶切圖譜；系統掌握瓊脂凝膠電泳的基本技術。［實驗原理］限制性內切核酸酶（也可稱限制性內切酶）是在細菌對噬菌體的限制和修飾現象中發現的。細菌細胞內同時存在一對酶，分別為限制性內切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修飾作用）。它們對DNA底物有相同的識別順序，但生物功能卻相反。由于細胞每存在DNA甲基化酶，它能在限制性內切酶所識別的若干堿基上甲基化，就避免了限制性內切酶對細胞自身DNA的切割破壞，而對感染的外來噬菌體DNA，因無甲基化而被切割破壞。所以限制性內切酶是該細菌細胞的衛士，它與DNA甲基化酶一齊構成了保護自己、抵抗外源入侵的DNA防御機制。目前已發現的限制性內切酶有數百種。EcoRI和HindIII都屬于II型限制性內切酶，這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA分子的特異核苷酸順序的能力，能在這個特異性核苷酸序列內，切斷DNA的雙鏈，形成一定長度和順序的DNA片斷。EcoRI和HindIII的識別序列的切口是：EcoRI:GJAATTCHindIII:AJaGCTTG,A等核苷酸表示酶的識別序列，箭頭表示酶切口。限制性內切酶對環狀質粒DNA有多少切口，就能產生多少個酶切片段，因此鑒定酶切后的片斷在電泳凝膠中的區帶數，就可以推斷酶切口的數目，從片斷的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。用已知相對分子質量的線狀DNA為對照，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對分子質量。［實驗器材］儀器和材料電泳儀、電泳槽，樣品槽橫板（梳子），有機玻璃內槽，橡皮膏，錐形瓶（100mL或50mL）,玻璃紙，一次性塑料手套。pUC19（市售和自提），EcoRI酶，ADNA-HindIII酶切的分子量標準、瓊脂糖。試劑（1）TAE緩沖液（1XTAE）：稱取Tris4.9g、EDTA-Na2—2H2O0.74g，用900ml蒸餾水分別溶解后，添加冰醋酸1.14ml，最終用蒸餾水定容至1L。（2）酶反應終止液（10X）：兩種反應終止液可供選擇。①0.1mol/LEDTA-Na2，20%FiCoLL，適量橙G。②0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF（或稱二甲苯藍），40%蔗糖水溶液（m/V）（或用30%蔗糖水溶液）。［實驗步驟］1質粒DNA的酶解編號123456市售的pUC19（微升）003300自提的pUC19（微升）660066EcoRI（微升）202020Buffer5x222222H2O/（微升）023502總體積/（微升）101010101010質粒DNA酶解的反應成分及加樣量2，瓊脂糖凝膠板的制備（1）瓊脂糖凝膠的制備：稱取0.14g瓊脂糖，置于藍蓋試劑瓶中，加入20mlTAE緩沖液，置于高壓滅菌鍋內加熱，鍋內壓力為至121kPa時維持10min,瓊脂糖即可全部融化在緩沖液中，取出搖勻，則為0.7%瓊脂糖凝膠液。（2）膠板的制備：取有機玻璃內槽，洗凈、晾干。（3）放好樣品加樣孔合適的梳子。（4）將冷卻至65度左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機玻璃內槽上，控制灌膠速度，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右。（5）待凝膠完全凝固后，將鋪膠的有機玻璃內槽放在電泳槽內備用，加入足量電泳緩沖液。（6）輕輕拔出梳子。3，加樣（1）預先染色DNA（2）用微量加樣器將樣品加入膠版的樣品小槽內，加樣時槍頭垂直于樣品槽上方，注意不能碰到樣品槽的凝膠面。（3）每次加完一個樣品，及時更換槍頭，以防止相互污染。加樣時，應防止碰壞樣品槽周圍的凝膠面。4，電泳正確連接正負極，DNA向正極移動。加完樣品后的凝膠板立即通電，進行電泳。但要注意控制一定的