1移液器的使用與校準實驗用移液器的使用移液器基本上替代了過去的玻璃刻度吸管，作為一種方便有效的精密計量器材已廣泛用于各類實驗。

基本原理：依靠活塞的上下移動實現吸液和放液。科研人員的基本功，是科學實驗的第一步，熟練掌握是保證實驗結果正確可靠的前提和條件。目前實驗室常用的移液器主要有空氣移液器，活塞正移液器，多道移液器以及電子移液器。[Imageinformationinproduct]Image:Notetocustomers:ThisimagehasbeenlicensedtobeusedwithinthisPowerPointtemplateonly.Youmaynotextracttheimageforanyotheruse.實驗用移液器的使用正確的安裝錯誤的安裝卸掉Tip頭Tip頭的安裝和卸掉實驗用移液器的使用1.移液之前，要保證相同溫度。吸取液體時，保持豎直狀態，將槍頭插入液面下2－3毫米。在吸液之前，可以先吸放幾次液體以潤濕吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度與水不同的液體時）切忌Tip頭在液體里吹泡泡。一是前進移液法。用大拇指將按鈕按下至第一停點，然后慢慢松開按鈕回原點。接著將按鈕按至第一停點排出液體，稍停片刻繼續按按鈕至第二停點吹出殘余的液體。最后松開按鈕。二是反向移液法。此法一般用于轉移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的液體。移液的方法

實驗用移液器的使用千萬不要將旋鈕旋出量程移液器在不同使用情況下的存在的問題從大體積調節至小體積時，為正常調節方法，逆時針旋轉刻度即可，從小體積調節至大體積時，可先順時針調至超過設定體積的刻度，再回調至設定體積，可保證最佳的精確度。（見圖1）實驗用移液器的使用你的移液器準確嗎？？-------移液器的精準性檢測

？不同量程范圍的移液器的校準方法<1μl應用分光光度計檢測≥1μl用精密分析天平測定重量1-10μl從預裝蒸餾水的稱量管中取出一定量蒸餾水，進行扣除計算的方法稱量

>10μl用預潤的吸頭將蒸餾水加入稱量管中的方式稱重，多道移液器用預潤的吸頭加入稱量管中的方式稱重，每一通道都要進行校準（根據水在20℃時的密度0.9982計算體積）實驗用移液器的使用你的移液器準確嗎？？-------移液器的精準性檢測

？

移液器允許誤差和測量的重復性標容量/uL檢定點/ul容量允許誤差±（%）測量重復性≤（%）

0.1201010.52010

1126

0.2201021126

2126

112610584

1084

2126201084

2042

10841005031.5

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204220010021

2001.51

10021100050010.5

100010.5實驗用移液器的使用實驗材料

儀器：電子天平試劑：蒸餾水移液器(P1000/P200/P20)尖端管（槍頭）(1000ul/200ul)

小量杯

實驗用移液器的使用實驗步驟實驗前的準備工作1、選擇1000P、200P、20P的移液器。2、反復練習怎樣使用移液器。3、將小量杯放到電子天平中，并將天平調零。實驗用移液器的使用實驗步驟1、調節微量移液器，使讀數顯示為所要取液體的體積。2、吸取液體。3、將吸取的液體放入稱量瓶中。4、觀察電子天平，并記錄數值。5、每次用天平讀取數值后要清零。6、按下吸液管活塞下側的按鈕，將尖端管退到垃圾桶中。實驗用移液器的使用實驗結果計算：容量允許誤差±（%）【（平均體積-理想體積）/理想體積】X100測量重復性≤（%）【（測量體積-平均體積）/平均體積】X100實驗用移液器的使用

移液器允許誤差和測量的重復性標容量/uL檢定點/ul容量允許誤差±（%）測量重復性≤（%）

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100010.5實驗用移液器的使用禹曉童，楊燕琳，陳櫟北京大學第三醫院中心實驗室2016-12-3組織學技術

及免疫組織化學中心實驗室組織病理學分析平臺平臺設備工作內容地點辦公電話組織病理學技術和形態學分析全套先進的病理切片制作和圖像分析設備協助研究生和科研人員進行組織病理學相關的實驗設計、技術指導和服務科研樓8套病理分析設備專業技術人員黃琛講師，博士，博士后專業：病理學與病理生理學。主要從事干細胞生物學、腫瘤病理學與腫瘤基因組學、基因芯片生物信息學分析等方面研究。楊燕琳主管技師專業：病理學技術。負責病理學教學、科研和外檢。陳櫟技士負責科研臨床病理制片及免疫組化。禹曉童技師專業：病理學與病理生理學。負責臨床病理制片及免疫組化、特殊染色。免疫組織化學技術特殊染色免疫組織化學技術第一個問題：為什么選擇采用免疫組織化學技術這種實驗方法？導師安排課題研究A因素與B疾病/病變/狀態的關系KeywordsA因素B疾病/病變/狀態相互關系冠狀動脈粥樣硬化α-平滑肌肌動蛋白查文獻、看綜述B疾病/病變/狀態A因素A因素是什么與類似疾病或病變的關系定義病因病理和分類臨床表現疾病分期輔助檢查診斷和鑒別診斷治療和預后DNAmRNA蛋白質A因素A因素是什么類似疾病或病變中的變化DNAmRNA蛋白質DNA基因序列單一基因？家族？是否存在亞型？單核苷酸多態性(SNP)堿基突變染色體定位DNA基因序列單一基因？家族？是否存在亞型？染色體定位NCBI檢索DNA基因序列單核苷酸多態性(SNP)堿基突變高通量檢測低通量檢測微陣列芯片高通量測序PCR后，SSCP、RFLP、測序原位雜交實時熒光定量PCR-SNP基因分型分析少樣本，多基因初篩多樣本，單基因mRNA剪接變異體表達量高通量檢測低通量檢測微陣列芯片高通量測序原位雜交RT-PCR少樣本，多基因，初篩多樣本，單基因實時熒光定量PCR蛋白表達量細胞內定位改變翻譯后修飾蛋白檢測原理：將待測的目標蛋白當作抗原，采用特定的商品化抗體，以抗原-抗體結合的免疫反應為原理，使抗體與待測目標蛋白結合，再利用顯色劑、熒光指示劑等方式，顯示蛋白的表達量或定位。WesternBlottingFCMELISA免疫組化免疫熒光蛋白表達量細胞內定位改變翻譯后修飾細胞內定位改變WesternBlotting細胞、組織定性、定量FCM懸浮細胞定性、定量同時檢測多個指標ELISA細胞液、上清液、組織液定量免疫組化免疫熒光免疫組化免疫熒光原位、定性、定量（光密度、陽性細胞表達率）可雙染原位、定性、定量（陽性細胞表達率）、可雙染WesternBlotting免疫組化有時，免疫組化的差異在WB中無法體現。中心法則(CentralDogma)單核苷酸多態性堿基突變剪接變異體表達量表達量細胞內定位改變翻譯后修飾PCR后，SSCP、RFLP、測序RT-PCR、定量PCRWesternBlotting原位雜交原位雜交FCMELISA免疫組化免疫熒光熒光定量PCR階段性總結免疫組織化學技術(IHC)原位蛋白質檢測技術，以免疫學抗原抗體反應為原理，運用物理和化學方法顯示抗原-抗體反應結果，形成可見的最終有色產物，在對組織、細胞進行傳統形態學觀察的同時，對組織和細胞內特定蛋白質進行定位、定性、定量檢測。原位蛋白質檢測抗原抗體反應物理和化學方法顯示反應結果，形成可見產物形態學觀察定位、定性、定量抗原抗體反應抗原（antigen，Ag）：能啟動機體免疫應答，并與其應答產物結合，發生一系列生物學效應的物質。特征免疫原性：引起抗體形成的能力。反應原性：可與其誘發生成的相應抗體發生特異

性結合反應。耐受原性：在一定條件下又可以阻礙抗體的形成。待測蛋白=抗原組織切片細胞爬片抗原抗體（antibody，Ab）：機體受到抗原刺激，通過體液免疫應答，B細胞活化、增殖、分化為漿細胞，由漿細胞合成并分泌僅與該抗原發生特異性結合反應的免疫球蛋白。第一抗體(一抗)商品化抗體多克隆抗體單克隆抗體多克隆抗體

(polyclonalantibody，pAb)血清抗體，是機體接受抗原主動或被動免疫后，從血清中分離提純的抗體。分泌抗體抗原注射入動物體內1抗原激活B細胞抗原B細胞2形成記憶性B細胞克隆3a形成漿細胞克隆3b抽取含有抗體的血清，分離、純化后獲得多克隆抗體5生成來源于不同B細胞的多克隆抗體4單克隆抗體

(monoclonalantibody，mAb)mAb由一個雜交瘤細胞克隆產生，只針對一個抗原決定簇，所有抗體分子在結構上完全一致，具有高度特異性和穩定性。抗原注射入動物體內1脾臟2分離脾臟B細胞人骨髓瘤細胞融合3B細胞與體外培養的人骨髓瘤細胞株融合選擇性細胞培養基培養雜交瘤細胞存活B細胞和人骨髓瘤細胞死亡45雜交瘤A雜交瘤B雜交瘤C雜交瘤D單個雜交瘤細胞形成克隆6mAbAmAbBmAbCmAbD單個雜交瘤細胞克隆分泌單克隆抗體物理和化學方法顯示反應結果，形成可見產物能與抗體形成牢固的共價鍵結合不影響抗原抗體結合具有信號放大效應發光或顯色反應主要發生在抗原一抗體結合原位，并與周圍有較高對比度。標記物抗原抗原抗體結合形成Ag-Ab復合物本身不可見，必將抗體加以標記，利用標記物發光，或與其他物質的反應才能形成可見發光或顯色。一抗辣根過氧化物酶HRP堿性磷酸酶AP葡萄糖氧化酶GOD優點穿透力強，穩定，特異性高，不溶性好底物多，敏感性高，顯色時間范圍寬終產物穩定，易永久保存缺點特異性受內源性過氧化物酶影響分子大，穿透力弱，受內源性AP干擾分子大，穿透力弱，與底物反應敏感性低適用范圍IHC，WB原位雜交，雙重酶標IHC，原位雜交，WB，ELISA等顯色劑DAB(棕黃)，AEC(紅，水溶性封片劑)BCIP/NBT(藍)，快藍(藍)，快紅(紅)，水溶性封片劑NBT，TNBT，INT常用抗體標記酶標記物顯色熒光標記物異硫氰酸熒光素(FITC)異硫氰酸羅丹明(TRITC)Cy3Cy5標記物發光+二抗標記物1標記物與二抗結合標記的二抗抗原一抗+2一抗與抗原結合3二抗與一抗結合4標記物自發光或顯色選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑5S原則Specificity：特異性，最重要Sensitivity：敏感性Simplicity：簡便性Safety：安全性Save：省時省錢選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑1.抗體公司網站，查詢抗體不建議選擇羊來源的一抗做免疫組化，不建議使用santacruz公司的抗體說明書明確寫出可做石蠟標本2.下載抗體說明書，仔細閱讀，選定一抗抗體來源QuantitysizeBackgroundSpecificityFormatApplicationContentsStorageReference來源動物種屬單克隆？多克隆？夠用？浪費？蛋白功能細胞定位IgG？IgM？反應種屬液體？粉末？可用于的檢測方法、參考濃度范圍抗體產生方式溫度時間使用該抗體的文章選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑抗體來源QuantitysizeBackgroundSpecificityFormatApplicationContentsStorageMouse單克隆100μl胞漿蛋白IgG大鼠、人液體IHC,50-500腹水4℃1年Mouseanti-α-smoothmuscleactin，BM0002，博士德選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑DAKO,Envision系統中杉,PV-600系統抗體來源反應動物種屬反應的球蛋白種類標記物標記酶來源動物種屬與一抗來源的動物反應生物素？0.001-0.01g/L卵白素去除內源性生物素IgG？IgM？HRP？AP？過氧化氫去除內源性過氧化物酶即用型工作液反應底物溶液中加入左旋咪唑，抑制內源性AP活性選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑中杉,PV-6002抗體來源反應動物種屬反應的球蛋白種類標記物標記酶SheepMouseIgGHRP過氧化氫去除內源性過氧化物酶選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)DAB(二氨基聯苯胺)HRP在過氧化物酶的催化下，電子供體AEC生成穩定的紅色產物。該產物不溶于水，但溶解于有機溶劑。水性封片劑在過氧化氫的存在下，DAB失去電子顯色并累積，形成棕褐色不溶性產物，并不溶于水和醇類溶液。DABAEC選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑BCIP/NBTAP水性封片劑在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP會被水解產生強反應性的產物，產物與NBT反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色的產物。BCIP:

5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽NBT:Nitrobluetetrazolium

chloride，氯化硝基四氮唑藍快紅，快藍在堿性磷酸酶的催化下，快紅或快藍生成穩定的紅色或藍色產物，不溶于水，但溶解于有機溶劑。CEA，BCIP/NBTER，快紅選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑DAB(二氨基聯苯胺)HRP在過氧化氫的存在下，DAB失去電子顯色并累積，形成棕褐色不溶性產物，并不溶于水和醇類溶液。選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑Mouseanti-α-smoothmuscleactin，BM0002，博士德DAB(二氨基聯苯胺)中杉,PV-6000HOMEWORK動手實驗?選擇一抗選擇二抗系統選擇顯色劑Mouseanti-α-smoothmuscleactin，BM0002，博士德DAB(二氨基聯苯胺)中杉,PV-6000HOMEWORK動手實驗?NO!!實驗前準備臨床樣本動物模型培養細胞獲得標本熟悉實驗操作試劑耗材訂購標本準備制定實驗計劃IHC標本IHC組織取材與固定組織病理制片技術根據特定實驗內容，確定取材、固定方案組織細胞取材固定的基本流程組織取材光鏡：HE染色特殊染色免疫組織化學(IHC)原位雜交(ISH)電鏡：IHC蛋白質、核酸提取分子生物學實驗-20℃保存免疫熒光(IF)、IHC、ISH冰凍包埋石蠟包埋凍存冰凍切片冰凍切片石蠟切片固定不固定臨床手術切除、活檢穿刺、尸體解剖、動物模型標本固定活細胞光鏡：HE染色特殊染色免疫組織化學(IHC)原位雜交(ISH)電鏡：IHC蛋白質、核酸提取分子生物學實驗固定IF、流式細胞術凍存細胞爬片細胞培養外周血、胸腹水和腦脊液手術切除、活檢穿刺、動物模型標本細胞離心涂片細胞離心后包埋制片細胞懸液做特定實驗前，必須進行HE染色觀察組織質量組織有夾痕組織脫水熟悉實驗操作IHC實驗步驟注意事項免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復染分化、返藍上行脫水透明封片劑封片可選脫蠟和水化蠟不溶于水，不與抗體、染料相融合。必須徹底清除干凈切片上的蠟，否則將影響染色，造成切片染色不均。二甲苯用于溶解切片中的石蠟，乙醇用于洗脫二甲苯。二甲苯可以溶解于乙醇中。再用水置換出乙醇，水化切片，染料或抗體才能進入細胞中，進行染色或反應。(1)將石蠟切片60℃干烤2hr，或37-40℃干烤過夜。(2)將石蠟切片浸入二甲苯替代物15min×3次，無水乙醇5min×2次，95%乙醇5min×2次，80%乙醇5min。(3)蒸餾水中浸泡2min。脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶切片浸入新鮮配制的3%甲醇-H2O2避光孵育10-15min。組織細胞（如紅細胞、中性粒細胞、單核細胞嗜酸性細胞、出血壞死組織）中含有內源性過氧化物酶，DAB顯色時，可以與HRP一樣催化底物，使之顯色H2O2溶液可與過氧化物酶反應，而甲醇對各種酶都有鈍化作用，因此3%甲醇-H2O2溶液的雙重作用效果較好。脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌自來水沖洗，蒸餾水5min×2次，PBS

5min×3次。PBS需提前配制，調PH值。中杉金橋PBS粉末，PH7.2-7.4。脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復目的：暴露抗原。原因：固定液和石蠟導致組織蛋白的氨基酸殘基在分子內或分子間形成醛鍵，或發生蛋白交聯，導致蛋白質三級或四級結構改變，出現空間阻礙，從而封閉抗原決定簇。方法：酶消化法：0.1%胰蛋白酶、0.4%胃蛋白酶液、0.1%鏈霉蛋白酶某些細胞內抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細胞間質抗原（如Laminin、CoIV等）需用酶消化法。胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細胞內抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。抗原熱修復：高溫高壓修復、煮沸修復、微波修復[0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)

]高溫高壓熱修復：(1)取一定量的0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）于壓力鍋中。(2)將切片置于耐高溫塑料切片架上，切片位于液面以下，蓋鍋加閥，高火加熱至加壓閥快速噴氣，調電爐至100度計時2min。(3)壓力鍋離開熱源，沖水快速冷卻開蓋，晾涼至室溫。修復液使用前恢復到室溫。熱處理后，切片自然冷卻，并防止切片干燥。應根據不同的抗體選擇合適的抗原修復方法。一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持一致。注意形態學結構的改變(過度高溫修復會破壞胞漿和胞核，出現核破裂、蘇木素淡染等現象。過度酶水解對胞漿的破壞視消化時間而異，但核破壞較輕)。如果在常用緩沖液中無法實現抗原修復，或經修復后抗原定位發生改變，可改用一些不常用的緩沖液，或添加螯合劑如EDTA等，可改善某些抗原的修復。操作注意事項脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌取出切片，PBS

5min×3次。脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉可選細胞表面（特別是淋巴造血組織，淋巴細胞，單核細胞，組織細胞表面）存在Fc受體，可與抗體(Ig)結合，形成非特異性染色。主要是與二抗的非特異性結合。二抗來源動物種屬的正常血清可避免抗體(Ig)與Fc受體結合。5%二抗來源動物種屬的正常血清或5%牛血清白蛋白(BSA)，可避免抗體蛋白吸附于組織切片中高電荷的膠原和結締組織成分上，用于封閉組織切片的蛋白疏水基團。滴加正常血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，勿洗。脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育滴加50-100μl一定稀釋濃度的一抗工作液于組織上，4℃過夜或37℃2小時。液體邊緣大于組織邊緣3mm實驗切片：一定稀釋度的一抗陰性對照片：PBS陽性對照片：一定稀釋度的一抗一抗的稀釋度一抗稀釋度1:50一抗稀釋度1:500抗體稀釋液必須根據說明書要求，如無特殊要求可以采用商品化的一抗稀釋液，或PBS。根據抗體說明書要求存放抗體。分裝使用的tube和tip必須是消毒滅菌的。分裝體積根據自己實驗情況確定。一抗的稀釋、分裝和儲存免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育洗滌取出切片，PBS

5min×3次。免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌滴加50-100μl二抗工作液于組織上，室溫30min。液體邊緣大于組織邊緣3mm免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌取出切片，PBS

5min×3次。免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液根據DAB顯色試劑盒說明書：每毫升A液（DAB稀釋液）中加1滴（或20μl）B液（DAB原液）的濃度配制所需要的用量，混勻后備用。避免強光照射。免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色DAB顯色滴加顯色劑DAB工作液50-100μl，光鏡下控制顯色。事先準備自來水，工作臺鋪報紙。顯微鏡事先調整到相應視野范圍（用HE染色切片，10X）。切片擦干后滴入DAB。定時器記時（正記時）。顯色完成后及時放入自來水清洗。顯色后清理工作區，關閉顯微鏡。DAB顯色時間第一抗體1:501:1001:2001:40015

s++(－)++(－)+(－)(－)30s++++(±)+++(±)+++(－)+(－)45s++++(+)+++(+)+++(±)+(－)60s++++(++)++++(++)+++(+)+(－)注：陽性強度與背景染色以“+”表示，括號內為背景染色。DAB顯色時間的棋盤測定法DAB顯色時間第一抗體1:501:1001:2001:40015

s++(－)++(－)+(－)(－)30s++++(±)+++(±)+++(－)+(－)45s++++(+)+++(+)+++(±)+(－)60s++++(++)++++(++)+++(+)+(－)注：陽性強度與背景染色以“+”表示，括號內為背景染色。DAB顯色時間的棋盤測定法免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌顯色完全后，自來水沖洗終止顯色。免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復染細胞核內脫氧核糖核酸（DNA）呈酸性，易與帶正電荷的蘇木精堿性染料結合。蘇木素在堿性溶液中呈藍色，故細胞核被染成藍色。切片浸入蘇木素染液，染色時間根據染液要求確定。如蛋白表達需要進行光密度測定，需做兩張免疫組化，一張復染蘇木素觀察組織結構和細胞染色，另一張進行光密度分析。蘇木素復染免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復染分化、返藍分化：過染的細胞核和不應著染蘇木精的細胞漿等組織成分脫色，從而使著染的細胞核與細胞漿及細胞周圍的組織成分對比清晰。分化時間的長短視組織性質，切片厚薄，蘇木素染色深淺和分化液的新舊來決定，一般是2-5秒鐘，若切片不分化或分化不足，細胞核和細胞漿均著染，使組織結構對比不清晰；若分化過度，細胞核過淡或褪色。返藍：堿性溶液使蘇木素恢復藍色。1％鹽酸溶液分化，自來水洗滌，再1％氨水返藍。顯微鏡下觀察復染情況，可反復蘇木素復染、分化、返藍至滿意結果。

分化、返藍免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復染分化、返藍上行脫水透明封片劑封片95%乙醇2min×2次，無水乙醇2min×2次，二甲苯替代物5min×2次脫水：去除組織細胞中的水分，利于長久保存和后續處理。透明：使細胞的色度及細胞的重疊不影響鏡下的觀察。上行脫水透明免疫組織化學技術實驗步驟脫蠟和水化3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶洗滌抗原修復洗滌血清封閉一抗孵育二抗孵育洗滌洗滌配制DAB工作液DAB顯色洗滌蘇木素復染分化、返藍上行脫水透明封片劑封片中性樹膠封片。切片陰干，避免強光照射。三天后，等樹膠完全干燥后，盡快進行圖像采集。蓋玻片保護標本不受機械損壞或氧化，保護鏡頭不被標本污染，防止細胞干皺卷曲產生褐色素，使細胞透明折光性好。用二甲苯調制的中性樹膠封片。封片方式采用濕封，切片從二甲苯透明完畢后取出后應使其帶有部分二甲苯，然后在細胞中心滴加適量樹膠，再蓋上蓋玻片。這時滴加中性樹膠切片就能完好封存。封片劑封片

染色前處理取材、脫水、浸蠟、脫鈣組織固定為確保離體組織的抗原性，組織離體后一般在15min內固定，固定液體積為組織體積的10-15倍，常溫下固定8-24hr或4℃固定一周，盡快脫水包埋。中性甲醛固定可引起組織抗原決定簇的封閉和交聯，必須通過抗原修復進行修正。中性甲醛和70%乙醇固定時間過長，會造成組織抗原損失，新鮮組織固定一周后抗原丟失嚴重，幾乎不能被檢出。免疫組織化學技術的實驗注意事項防脫片在整個實驗操作流程中都必須防脫片。黏附載玻片。切片厚度不宜超過5μm，切片后及時烘烤。使用多聚賴氨酸等玻片黏附劑預先處理載玻片。染色時，組織不能干燥，不能長時間置于緩沖液中。包埋與切片固定后的組織在高溫石蠟中包埋容易導致抗原破壞，需選用低熔點石蠟。切片保存：不能室溫存放，短期4℃存放，長期-20或-80℃存放。脫蠟：必須徹底，否則影響染色。抗原修復抗原修復后的切片應充分洗滌，以去除抗原修復液對抗原抗體結合的影響。熱修復后的切片應自然冷卻。同一批抗原的檢測時間和溫度必須保持一致。需注意抗原修復對切片組織形態的影響，根據實驗需要選擇修復方法和修復液。內源性過氧化物酶的滅活使用過氧化物酶檢測系統，必須采用3%H2O2封閉內源性過氧化物酶。血清封閉：二抗來源種屬相同的正常血清。一抗保存：嚴格按照說明書。一抗與免疫組化檢測系統的正確配套酶標抗體系統中的酶與顯色劑的合理選用HRP系統采用DAB和AEC顯色。AP系統采用快紅、快藍或BCIP/NBT顯色復染：蘇木素或Giemsa對照染色實驗的合理設立：必須有陽性對照和陰性對照。免疫組織化學技術的結果分析和判斷判斷原則必須設染色對照。抗原表達必須在特定部位。陰性結果不能視為抗原不表達。盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達。對免疫組化標記結果的意義不能絕對化。每一次IHC實驗必須設定的對照陽性對照空白或替代對照陽性對照用已證實含靶抗原的標本片與待檢標本片同時做同樣處理染色的組織對照。陽性標本片得到的陽性結果，表明所用抗體、各種試劑和操作步驟的可靠性，證實所用IHC染色流程的有效性，排除假陰性的可能。陽性對照標本可選自相同組織樣本，也可選擇不同來源組織，但必須事先證實含有待測靶抗原。陽性對照在每一批IHC染色都不可缺少，且對同一批的不同靶抗原也應分別設置。陰性對照陰性試劑對照-空白或替代對照用緩沖液或一抗同源動物未免疫的正常血清取代一抗的對照染色。缺少免疫試劑的同步處理和標記染色的IHC對照。用于證實IHC染色所用試劑，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性的同步對照標本片染色。每一批IHC染色中絕不可缺少的對照設置。骨肉瘤，Ki67骨肉瘤，空白對照心臟，HE染色心臟，HE染色心臟，HE染色心臟，空白對照心臟，α-SmoothMuscleActin自身對照在同一標本片上，靶抗原的陽性反應與其他無關成分或結構的陰性結果可形成鮮明對照。無需另外步驟或試劑。陽性對照標本可選自相同組織樣本，也可選擇不同來源組織，但必須事先證實含有待測靶抗原。目的在于排除內源性干擾產生的假陽性或抗原彌散位移所造成的錯誤結果。GAD67，神經元標記抗原表達必須在特定位置陽性表達必須在細胞和組織特定的抗原部位才能視為陽性。不在抗原所在部位的陽性表達一律不能視為確切的陽性結果，只能視為陽性著色。難以確定或存在爭議的陽性分布，必須經過對照染色結果加以證實。細胞漿蛋白肝癌Peroxiredoxin3蛋白-棕色，細胞核-藍色細胞核蛋白子宮內膜MCM2蛋白-棕色，細胞核-藍色細胞膜蛋白卵巢腺癌ErbB2蛋白-棕色，細胞核-藍色陰性結果不能視為抗原不表達陰性結果不能不加分析的認定具有否定意義。陽性表達具有強弱、多少之分，即使只有少數細胞陽性，也要視為陽性表達。避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達酶免疫標記檢測時，由于內源性酶的干擾，出血壞死區呈彌漫性成片著色。切痕和組織片周邊，由于界面不平整，標記試劑殘留干擾，呈非真實的抗原陽性標記對免疫組化標記結果的意義不能絕對化當IHC結果與HE切片診斷不一致時，應綜合分析。組織壞死組織折疊實驗序號待測樣本陽性組織陰性組織空白對照結果判斷1－－－－假陰性，方法不可靠或操作有誤2＋＋＋＋假陽性，非特異染色，需尋找原因3＋＋＋－可疑，陰性組織對照片選擇不準確，含有靶抗原4＋－－－可疑，陽性組織對照片選擇不準確，不含靶抗原5＋＋－＋假陽性，非特異性染色，與二抗交叉反應有關6＋＋－－陽性，可靠，待測樣本中含靶抗原7－＋－－陰性，可靠，待測樣本中不含靶抗原IHC染色結果分析非特異性染色IHC染色過程中產生的非靶抗原(或抗體)的顯色結果，屬假陽性，又稱背景著色。組織內源性成分的干擾標記物的干擾抗體的干擾組織處理不當組織內源性成分的干擾自發熒光組織未經熒光色素染色，在紫外線或短光波照射下呈現的熒光。膠原纖維和彈性纖維-藍綠色軟骨和角蛋白-黃綠色脂褐素-棕黃色除結締組織外，自發熒光一般較弱，可根據其形態和部位進行判斷。視網膜色素上皮層與脈絡膜層CD29蛋白-綠色，脂褐素-黃色，細胞核-藍色誘發熒光某些物質天然狀態下本身不產生熒光，經過簡單化學處理后可轉變為發射熒光。甲醛固定后的去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺-黃綠色5-羥色胺-黃色。內源性過氧化物酶白細胞及組織內含有過氧化物酶，紅細胞的血紅蛋白也可以產生假過氧化物酶反應。內源性生物素在新鮮未固定組織的肝、胰、腎等實質細胞內含有內源性生物素或生物素樣物質。紅細胞非特異性染色標記物的干擾熒光素和辣根過氧化物酶熒光素和酶自身質量差。親和素親和素為含糖基的堿性蛋白，能與組織中糖蛋白和細胞的負電荷發生非特異結合，引起背景著色。鏈霉親和素等電點為中性，不含糖基，可避免非特異結合。抗體的干擾抗體蛋白與組織的非特異吸附主要是物理吸附。應用未純化的多克隆抗血清時更為常見，抗血清中的凝集蛋白也能與組織結合。免疫原的交叉反應用作制備特異性抗體的免疫原(抗原)提取不純或者某些組成成分具有共同的抗原決定簇，由此而生成的抗體會造成“非期待”的“特異性”結合。IgG之間的交叉反應IgG受體廣泛存在組織內，它與IgG的結合不受種屬限制，近系動物之間，尤其是未固定樣本中更易出現這種“非期待”的“特異性”結合。天然抗體的交叉反應動物血清中存在多種天然抗體，無種屬特異性，能與多種動物的纖維組織發生反應，造成非期待的著色。組織處理不當血清或分泌性抗原的干擾血清或分泌物中含有待測抗原，污染細胞。組織固定不及時細胞抗原彌散，造成定位不確切。組織自溶，增強了抗體蛋白與組織的非特異結合。操作流程不規范染色過程中，洗滌不充分造成游離試劑殘留。標準化組織病理圖像采集NakanoT,AndoS,TakataN,KawadaM,MugurumaK,SekiguchiK,SaitoK,YonemuraS,EirakuM,SasaiY.Self-FormationofOpticCupsandStorableStratifiedNeuralRetinafromHumanESCs.CellStemCell.2012,10(6):771-85.JanichP,PascualG,Merlos-SuárezA,BatlleE,RippergerJ,AlbrechtU,ChengHY,ObrietanK,DiCroceL,BenitahSA.Thecircadianmolecularclockcreatesepidermalstemcellheterogeneity.Nature.2011,480(7376):209-14.IF(2010)：25.943IF(2010)：36.101NakanoT,AndoS,TakataN,KawadaM,MugurumaK,SekiguchiK,SaitoK,YonemuraS,EirakuM,SasaiY.Self-FormationofOpticCupsandStorableStratifiedNeuralRetinafromHumanESCs.CellStemCell.2012,10(6):771-85.JanichP,PascualG,Merlos-SuárezA,BatlleE,RippergerJ,AlbrechtU,ChengHY,ObrietanK,DiCroceL,BenitahSA.Thecircadianmolecularclockcreatesepidermalstemcellheterogeneity.Nature.2011,480(7376):209-14.IF(2010)：25.943IF(2010)：36.101背景均一組織結構正規色調正常采集部位可充分展示結果圖像清晰心臟，α-SmoothMuscleActin免疫組化結果半定量分析陽性細胞面積（Area）平均光密度值（Density(Mean)）積分光密度值（IntegratedOpticalDensity,IOD）專業圖像分析軟件Image-ProPlus光密度分析光密度（OD）分析是，通過測量被傳輸的光數量（允許通過的）來確定材料中的物質含量。因為OD分析測量通過材料的光數量，所以只有當所分析的圖像在進行捕捉時光源是從材料背后輻射出來時，OD測試才有意義。例如：從顯微鏡載玻片中捕捉到的圖像（光是從材料的正下方穿過來的）或者在光盒中得到的膠片（光是從箱的背后穿過來的）。對于在反射光條件下捕捉到的圖像進行的分析，光密度測量沒有絲毫意義。在沒有光穿過材料時，其光密度為無窮大，而