藥物分析第十一章抗生素1第一頁，共四十三頁，2022年，8月28日含量測定或效價測定微生物學法——通過比較標準品與供試品產生抑菌圈的大小來測定供試品的效價。其原理恰好與臨床應用要求一致，更能確定抗生素的醫療價值。對于分子結構復雜、多組分的抗生素，生物學法是首選的效價測定方法。2第二頁，共四十三頁，2022年，8月28日本法的優點：靈敏、用量小，結果直觀適用范圍廣：純度好的、差的制品，已知或新發現的抗生素均適用，同一類型的抗生素不需分離，可一次測定其總效價。缺點：操作步驟多，測定時間長，誤差大等。3第三頁，共四十三頁，2022年，8月28日理化方法

——適用于提純的產品以及化學結構已確定的抗生素優點：迅速、準確、有較高的專屬性。缺點：對含有具同樣官能團雜質的供試品不適用，或需采取適當方法加以校正。而且當該法是利用某一類型抗生素的共同結構部分的反應時，所測得的結果，往往只能代表藥物的總的含量，并不一定能代表抗生素的生物效價。4第四頁，共四十三頁，2022年，8月28日第二節β-內酰胺類抗生素頭孢菌素族青霉素族一、化學結構與性質*****6-氨基青霉烷酸7-氨基頭孢菌烷酸5第五頁，共四十三頁，2022年，8月28日酸性：青霉素和頭孢菌素分子中的游離羧基具有相當強的酸性，大多數青霉素的pKa在2.5～2.8之間，能與無機堿或某些有機堿形成鹽。旋光性：青霉素族分子中含有三個手性碳原子，頭孢菌素族含有兩個手性碳原子，故都具有旋光性。6第六頁，共四十三頁，2022年，8月28日β-內酰胺環的不穩定性：

β-內酰胺環是該類抗生素的結構活性中心，其性質活潑，是分子結構中最不穩定部分，其穩定性與含水量和純度有很大關系。在酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子（銅、鉛、汞和銀）或氧化劑等作用下，易發生水解和分子重排，導致β-內酰胺環的破壞而失去抗菌活性。7第七頁，共四十三頁，2022年，8月28日二、鑒別試驗（一）呈色反應羥肟酸鐵反應青霉素及頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，β-內酰胺環破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。茚三酮反應（側鏈含-氨基酸結構）與重氮苯磺酸的偶合反應（側鏈含酚羥基）硫酸-甲醛試驗8第八頁，共四十三頁，2022年，8月28日（二）各種鹽的反應鉀、鈉離子的火焰反應有機胺鹽的特殊反應（如普魯卡因青霉素的重氮化-偶合反應）（三）色譜法高效液相色譜法（HPLC）薄層色譜法（TLC）中國藥典收載的頭孢菌素族藥物和大多數青霉素族藥物采用HPLC法進行鑒別。9第九頁，共四十三頁，2022年，8月28日（四）光譜法IR——各國藥典對收載的β-內酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進行鑒別。該類抗生素共有的特征峰：

－內酰胺環羰基的伸縮振動（1750～1800）仲酰胺的氨基、羰基的伸縮振動（3300cm-1±，1525cm-1±，1680cm-1±）羧酸離子的伸縮振動（1600cm-1±、1410cm-1±）UV——利用最大吸收波長鑒定法或利用水解產物的最大吸收波長鑒定法。10第十頁，共四十三頁，2022年，8月28日三、特殊雜質的檢查本類抗生素的特殊雜質主要有高分子聚合物，有關物質，異構體等，一般采用HPLC法控制其量，也有采用測定雜質的吸收度來控制雜質量的。11第十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日聚合物——HPLC法聚合物的檢查采用分子排阻色譜法。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經修飾凝膠如葡聚糖凝膠（sephadex）和聚丙烯酰胺凝膠（sepharose）等為填充劑。現以頭孢他啶中頭孢他啶聚合物的測定為例12第十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日色譜條件與系統適用性試驗

用葡聚糖凝膠G-10（40～120m）為填充劑，玻璃柱內徑1.3～1.5cm，床體積50～60mL；流動相A為含3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.0），流動相B為0.01%十二烷基硫酸鈉溶液；流速為每分鐘1mL；檢測波長為254nm。以流動相A為流動相，用1mg/mL藍色葡聚糖2000溶液進樣200L進行測定，理論板數應不低于900，拖尾因子在0.75～1.5，對照品溶液以流動相B為流動相，重復進樣200L，峰面積值的相對標準差應小于5.0%。排阻分子量在1000左右13第十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日對照品溶液的制備：取頭孢他啶對照品適量，精密稱定，加水制成含頭孢他啶100g/1mL的溶液，搖勻。測定法：取本品適量，精密稱定，加水制成含頭孢他啶20mg/1mL的溶液，立即進樣200L，以流動相A為流動相進行測定，記錄色譜圖；另取對照品溶液200L注入液相色譜儀，以流動相B為流動相，記錄色譜圖，按外標法計算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得過0.3%。14第十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日自身對照外標法的原理：該法是利用特定條件下β-內酰胺類抗生素可以締合成與高分子雜質有相似色譜行為的締合物，即在Kav=0處表現為單一的色譜峰。以藥物自身為對照品，測定其在特定條件下締合時的峰響應指標；然后改變色譜條件，測定樣品，記錄樣品色譜圖中Kav=0處的高分子雜質峰的響應指標，按外標法計算，即得樣品中高分子雜質相當于藥品本身的相對含量。Kav=有效分配系數15第十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日自身對照液樣品液流動相B——0.01%十二烷基硫酸鈉溶液流動相A——含3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液締合物高聚物A高聚物﹤A締合物16第十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日有關物質和異構體

例1頭孢呋辛酯中有關物質和異構體的檢查：色譜條件與系統適用性試驗：要求頭孢呋辛酯A，B異構體之間、頭孢呋辛酯A異構體與頭孢呋辛酯△3-異構體之間的分離度R﹥1.5。頭孢呋辛酯A，B異構體、△3-異構體及E異構體峰的相對保留時間分別約為1.0、0.9、1.2及1.7和2.1。

異構體——供試品色譜圖中A異構體峰的面積與A、B異構體峰的面積和之比應為0.48～0.55。有關物質——按自身對照法測定，E異構體不得過1.0%；△3-異構體不得過1.5%；其他單個雜質不得過0.5%并規定了總雜質量不得過3.0%。

17第十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日1頭孢呋辛；2異構體B；3異構體A；4△3-異構體；5,6E異構體△3-異構體是取頭孢呋辛酯對照品經加熱破壞處理而制得，E異構體經紫外光照射24h制得。頭孢呋辛酯是由兩個非對映異構體頭孢呋辛酯A和B組成的混合物18第十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日吸光度如青霉素鈉（鉀）的吸光度檢查：取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波長處測定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波長處有最大吸收，吸收度應為0.80～0.88。此法中264nm處吸收值用來控制青霉素鈉（鉀）的含量，280nm處吸收值用來控制雜質的量。19第十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日四、含量測定高效液相色譜法這是β-內酰胺類抗生素含量測定的主要方法。中國藥典收載的本類抗生素原料及制劑共約70種，應用HPLC法測定含量的有50多種，約占78%。本類藥物的HPLC法通常采用反相HPLC，以外標法計算含量。20第二十頁，共四十三頁，2022年，8月28日第三節氨基糖苷類抗生素這類抗生素的化學結構都是以堿性環已多元醇為苷元，與氨基縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素。主要有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龍霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等它們的抗菌譜和化學性質都有共同之處。21第二十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日一、化學結構與性質鏈霉素鏈霉素22第二十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日慶大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7C2CH3HHC20H41N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7C1aHHHC19H29N5O7慶大霉素23第二十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日二、鑒別試驗茚三酮反應——本類抗生素具羥基胺類和α-氨基酸的性質，可與茚三酮縮合成藍紫色化合物。N-甲基葡萄糖胺反應——水解，產生葡萄糖胺衍生物，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，再與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反應，生成櫻桃紅色縮合物。吡咯衍生物櫻桃紅色縮合物24第二十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日麥芽酚（Maltol）反應

在堿性溶液中，鏈霉糖經分子重排、擴環、消除反應，生成麥芽酚，與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。麥芽酚紫紅色為鏈霉素的專屬反應25第二十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日坂口（Sakaguchi）反應——鏈霉素水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍與8-羥基喹啉、次溴酸鈉反應，生成橙紅色化合物。為鏈霉素的專屬反應26第二十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日三、特殊雜質檢查及組分分析1、鏈霉素中鏈霉素B的檢查鏈霉素B是指甘露糖鏈霉素，由發酵產生,其生物活性僅為鏈霉素的20%~25%，能被甘露糖鏈霉素B苷酶水解成甘露糖和鏈霉素。中國藥典（2005）新規定了該項檢查，采用薄層色譜法測定。27第二十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日溶液配制供試品溶液：取本品0.25g，精密稱定，置回流瓶中，加入5ml新鮮配制的硫酸-甲醇溶液（397?

）溶解，加熱回流1h，冷卻，用甲醇沖洗冷凝管，合并沖洗液，并用甲醇定量稀釋成每1ml中含10mg的溶液，作為供試品溶液。對照溶液：精密稱取甘露糖對照品約36mg，置回流瓶中，同法處理后定量制成每1ml中含72g的溶液，作為對照溶液。28第二十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日TLC方法薄層板：硅膠G點樣：各10μl，分別點于同一薄層板上展開劑：甲苯-醋酸-甲醇（5025?25?）顯色劑：新鮮配制的1，3-萘二酚與硫酸混合溶液，在110C加熱數分鐘顯色。限度：供試品溶液所顯鏈霉素B斑點的顏色與對照溶液的主斑點比較，不得更深（3.0%）。L=×100%×100%=3.0%70×4.1310×1000C×4.13S×1000根據1mg甘露糖相當于4.13mg的鏈霉素B，則:限量？29第二十九頁，共四十三頁，2022年，8月28日2、硫酸奈替米星中有關物質的TLC檢查：供試品溶液：150mg/mL；標準品溶液（1）1.5mg/mL；標準品溶液（2）3mg/mL；標準品溶液（3）1.44mg西索米星/mL，點樣：各2L，展開劑：二氯甲烷-甲醇-濃氨溶液（4：4：2）顯色：0.2%茚三酮溶液，110℃加熱20min。30第三十頁，共四十三頁，2022年，8月28日結果：供試品溶液如顯雜質斑點，其顏色與標準品溶液（3）所顯主斑點相比較，不得更深（1%），其他雜質與標準品溶液（1）所顯主斑點相比較，均不得更深（1%），如有一點超過，應不深于標準品溶液（2）的主斑點（2%）。

注：奈替米星是由西索米星經化學衍生而成的半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能殘留西索米星，需進行控制。

樣西對1對2

供試品溶液：150mg/mL；標準液（1）1.5mg/mL；標準液（2）3mg/mL；標準液（3）1.44mg西索米星/mL31第三十一頁，共四十三頁，2022年，8月28日3、慶大霉素C組分測定慶大霉素C1、C2、C1a對微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，導致各組分的多少影響產品的效價和臨床療效。因此各國藥典均規定控制各組分的相對百分含量。慶大霉素無紫外吸收，當采用HPLC-紫外檢測器檢測時，需進行衍生化處理。由于其具有強極性和水溶性，為獲得理想的色譜結果，可采用離子對色譜法，以庚烷磺酸鈉為反離子。32第三十二頁，共四十三頁，2022年，8月28日如USP（29）利用慶大霉素C組分結構中的氨基與鄰苯二醛（OPA）、巰基醋酸在pH10.4的硼酸鹽緩沖液中反應，生成1-烷基-2-烷基硫代異吲哚衍生物，在330nm波長處有強吸收。ChP和BP曾采用USP同樣的方法測定慶大霉素C組分，但在現版藥典中分別改用了蒸發光散射檢測器和電化學檢測器。慶大霉素OPA巰基醋酸異吲哚衍生物33第三十三頁，共四十三頁，2022年，8月28日ChP（2005）采用蒸發光散射檢測器檢測色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（pH值范圍0.8～8.0）；0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92：8）為流動相，流速0.6ml/min；蒸發光散射檢測器檢測34第三十四頁，共四十三頁，2022年，8月28日系統適用性試驗分別稱取慶大霉素和小諾霉素標準品各適量，用流動相制成每1ml中各含0.2mg的溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖.C組分的出峰順序從第二個主峰計，依次為慶大霉素C1a、C2、小諾霉素、C2a、C1；

C2、小諾霉素和C2a峰之間的分離度應符合要求；連續進樣的小諾霉素峰面積的相對標準偏差應不大于2.0%。35第三十五頁，共四十三頁，2022年，8月28日測定法取小諾霉素標準品適量，精密稱定，分別用流動相制成每1ml中約含小諾霉素0.2mg、0.5mg和1.0mg的溶液作為標準品溶液（1）、（2）、（3）。取上述三種溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算標準品溶液濃度的對數值與相應的主峰面積對數值的回歸方程，相關系數（r）應不小于0.99；lg0.2lg0.5lg1.0lgAr≥0.9936第三十六頁，共四十三頁，2022年，8月28日另取本品適量，精密稱定，用流動相制成每1ml中約含慶大霉素2.5mg的溶液，同法測定，用回歸方程計算供試品中對應各組分的量（Xcx），并根據所得的各組分的量（Xcx）按下面公式計算出各組分的含量。式中Cx

為慶大霉素各組分的含量；C1應為25%～50%，C1a應為15%～40%，C2a+C2應為20%～50%。37第三十七頁，共四十三頁，2022年，8月28日第四節四環素類抗生素這類抗生素分子有四個環構成，故統稱為四環素類（tetracyclines）抗生素。一、化學結構與性質化學結構：四環素類抗生素，可以看作四駢苯或萘駢萘的衍生物。38第三十八頁，共四十三頁，2022年，8月28日性質1、酸堿性（具兩性）2、旋光性（有多個手性碳）3、紫外吸收和熒光（剛性平面結構）4、與金屬離子形成配位化合物5、不穩定性四環素類抗生素對各種氧化劑（包括空氣中氧在內）、酸、堿都是不穩定的，易發生差