第三講基因診斷與基因治療詳解演示文稿第一頁，共一百零五頁。（優(yōu)選）第三講基因診斷與基因治療第二頁，共一百零五頁。2023/2/143概念：

基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列。基因的改變，會導(dǎo)致各種表型的改變，進(jìn)而引起疾病的發(fā)生。

將基因或其組成部分發(fā)生異常的疾病統(tǒng)稱為基因病。第三頁，共一百零五頁。2023/2/144基因病分為三大類：一、單基因病：由單個基因突變引起的一類疾病。如：血友病、地中海貧血等。二、多基因病：由多個基因突變綜合作用引起的疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動脈硬化、糖尿病、先天畸形等。三、獲得性基因病：指外源基因（DNA）侵入，在機(jī)體產(chǎn)生疾病，一旦將其清除便可痊愈。如：艾滋病及各種微生物感染病。第四頁，共一百零五頁。2023/2/145第一部分基因診斷（DNAdiagnosis）一、基因診斷的概念和基本概況臨床診斷生化學(xué)診斷免疫學(xué)診斷臨床疾病診斷四種方式：以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)。（細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、代謝產(chǎn)物異常、特定蛋白分子識別差異等）基因診斷對患者基因直接分析第五頁，共一百零五頁。2023/2/146基因診斷基因蛋白質(zhì)性狀生化診斷基因診斷臨床診斷第六頁，共一百零五頁。2023/2/147基因診斷定義（概念）：

基因診斷是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測患者體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷或輔助診斷的方法。基因診斷是在DNA/RNA水平檢測分析基因的存在、結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)，與傳統(tǒng)診斷方法比較有其特點(diǎn)：第七頁，共一百零五頁。2023/2/148基因診斷的特點(diǎn)：1、病因診斷：直接瞄準(zhǔn)病理基因，不僅對表型出現(xiàn)的疾病作出診斷，還可能發(fā)現(xiàn)潛在的致病因素，如:確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因。2、特異性強(qiáng)、靈敏度高：選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴(kuò)增PCR技術(shù)。3、穩(wěn)定性高4、診斷范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)目的基因是否處于活化狀態(tài)均可。樣品可長期保存。可檢測正在生長的病原體或潛在病原體。（與以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)的診斷技術(shù)相比）第八頁，共一百零五頁。2023/2/149基因診斷的基本概況：伴隨分子生物學(xué)理論技術(shù)的發(fā)展而建立和發(fā)展。DNA雙螺旋遺傳密碼破譯DNA重組癌基因與抑癌基因研究地中海貧血病基因治療和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體開發(fā)

PCR、分子雜交等一系列技術(shù)發(fā)展第九頁，共一百零五頁。2023/2/1410二、基因診斷的對象1、病原生物的侵入病原體：病毒、支原體、細(xì)菌、寄生蟲檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學(xué)方法、基因診斷等。尤其是當(dāng)無抗體時，基因診斷成為唯一手段。2、先天遺傳性疾病遺傳性疾病:發(fā)病的原因?yàn)樘囟ɑ虻耐蛔儭５谑摚惨话倭阄屙摗?023/2/1411腫瘤的發(fā)生：

發(fā)病機(jī)理尚不清。

初步認(rèn)為是個別細(xì)胞基因突變而引起的細(xì)胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突變引起的疾病

（1）用核心順序的串聯(lián)重復(fù)序列組成探針進(jìn)行雜交研究，可同時檢出具有高度多態(tài)性位點(diǎn)。（2）用southern雜交得到DNA指紋圖譜個體識別、親子鑒定、法醫(yī)物證4、其他遺傳穩(wěn)定，個體特異，因而用于法醫(yī)和親子鑒定。第十一頁，共一百零五頁。2023/2/1412基因診斷的基本策略：1、檢測已知的能產(chǎn)生某種特定功能蛋白的基因

這些基因根據(jù)其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測定，致病時的基因改變亦較清楚。如：已被克隆的病毒、細(xì)菌、霉菌和寄生蟲的基因、與致病有關(guān)的癌基因、抗癌基因、

地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。第十二頁，共一百零五頁。2023/2/14132、檢測與某種遺傳標(biāo)志連鎖的致病基因遺傳連鎖－－同一染色體相鄰的二個或二個以上的基因或限制性酶切位點(diǎn)，由于位置十分靠近，在遺傳時分離幾率很低，常一起遺傳稱連鎖。染色體遺傳連鎖圖－－用限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)作遺傳標(biāo)志，定位與之相連鎖的正常基因與致病基因，建立相應(yīng)的遺傳連鎖圖譜。定位性克隆－－根據(jù)遺傳連鎖圖進(jìn)行定位性克隆，比較正常和異常基因的差別，可找出導(dǎo)致遺傳病的分子缺陷。定位性克隆策略是當(dāng)前基因診斷的重要基礎(chǔ)。第十三頁，共一百零五頁。2023/2/14143、檢測表型克隆基因針對多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾病）。表型克隆技術(shù)－－是將有關(guān)表型與基因結(jié)構(gòu)結(jié)合，直接分離該表型的相關(guān)基因，并對疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆，然后用作多種探針，來診斷多基因遺傳病。該策略既不需預(yù)先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受基因數(shù)目及其相互作用方式的影響。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和異常基因組尋找兩者之間的差異序列2、基因組錯配篩選技術(shù)：尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關(guān)的基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷第十四頁，共一百零五頁。2023/2/1415基因診斷的基本步驟：1、獲得待檢樣品：提取核酸（PCR提高靈敏度)2、制備和標(biāo)記核酸探針3、基因檢測分析第十五頁，共一百零五頁。2023/2/1416三、基因診斷的常用技術(shù)核酸分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）等位基因特異的寡核苷酸（ASO）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）基因芯片第十六頁，共一百零五頁。2023/2/14171、核酸分子雜交原理：利用核酸的變性、復(fù)性及堿基互補(bǔ)的性質(zhì)，用已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA/RNA雜交，檢測核酸樣品中是否存在與探針互補(bǔ)的同源核酸序列，進(jìn)行DNA或RNA定性定量分析。基因檢驗(yàn)的兩個必要條件：1、必需的特異探針（標(biāo)記的）2、必需的基因組DNA第十七頁，共一百零五頁。2023/2/1418核酸分子雜交－－核酸印跡雜交DNA印跡雜交（Southernblot）RNA印跡雜交（Northernblot）斑點(diǎn)印跡雜交（Dot-blot）原位雜交(situhybridization)第十八頁，共一百零五頁。2023/2/14192.核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段雜交加入標(biāo)記核酸探針檢測雜交信號標(biāo)記核酸探針預(yù)雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針第十九頁，共一百零五頁。2023/2/1420核酸印跡雜交基本過程：提取DNA或RNA→酶切→凝膠電泳→膠變

性處理（DNA）→轉(zhuǎn)印核酸片段到NC膜上。

（RNA可直接用變性膠電泳，轉(zhuǎn)膜）（1）制備樣品：第二十頁，共一百零五頁。2023/2/1421核酸印跡雜交基本過程：（2）制備探針：探針：一段能和待檢測核酸分子按堿基互補(bǔ)配對原則而結(jié)合的核酸分子片段。探針需要標(biāo)記可直接檢測的元素或分子。

如：同位素、熒光、生物素等第二十一頁，共一百零五頁。2023/2/1422核酸印跡雜交基本過程：核酸印跡雜交可檢測pg水平的靶分子（4）檢測：方法依標(biāo)記的探針而不同*放射性同位素*生物素*地高辛*熒光素（3）雜交：預(yù)雜交－－封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)雜交－－探針與核酸分子結(jié)合第二十二頁，共一百零五頁。2023/2/1423（1）Southern印跡雜交法第二十三頁，共一百零五頁。2023/2/1424（2）Northern印跡雜交法（Northernblotting）

（其基本過程類似于上述Southern法）

提取RNA樣本→RNA變性→瓊脂糖凝膠電泳分離→轉(zhuǎn)移至膜→探針（標(biāo)記DNA或RNA）與之雜交→顯影或顯色→檢測信號。

Northern法可用于檢測組織細(xì)胞中總RNA或mRNA

第二十四頁，共一百零五頁。2023/2/1425（3）斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交法：

基本過程：

將變性的DNA或RNA直接點(diǎn)到固相支持濾膜上→用標(biāo)記探針與之雜交→自顯影或顯色反應(yīng)→檢測雜交信號→分析結(jié)果。

優(yōu)點(diǎn)：

簡便、快速、靈敏、樣本用量少；

缺點(diǎn)：

特異性不高，有一定比例的假陽性。

第二十五頁，共一百零五頁。2023/2/1426第二十六頁，共一百零五頁。2023/2/1427（4）菌落雜交（colonyhybridization）該法可從大量細(xì)菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。第二十七頁，共一百零五頁。2023/2/1428（5）原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）

將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測特異的DNA或RNA序列。

細(xì)胞原位雜交

組織切片原位雜交

DNA-DNARNA-DNA

三類雜交

RNA-RNA

該法優(yōu)點(diǎn)：不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。有第二十八頁，共一百零五頁。2023/2/1429第二十九頁，共一百零五頁。2023/2/1430第三十頁，共一百零五頁。2023/2/14312、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)原理：以待擴(kuò)增DNA為模板，在互補(bǔ)模板兩端序列的寡核苷酸引物介導(dǎo)下，通過耐高溫DNA聚合酶催化下，按半保留復(fù)制機(jī)制沿模板鏈延伸，快速、特異地?cái)U(kuò)增特定的DNA。一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。（無細(xì)胞分子克隆技術(shù)）。第三十一頁，共一百零五頁。2023/2/1432耐高溫DNA聚合酶－－－Taq酶寡核苷酸引物：設(shè)計(jì)引物和確定退火溫度是PCR

成功的關(guān)鍵。PCR的基本過程：（循環(huán)程序）變性（95℃）→退火（55℃－65℃）→延伸（72℃）3～5分40’’～1分100bp/1分源自水棲高溫菌，最適反應(yīng)溫度為72℃，且經(jīng)90℃以上加溫后仍可在溫度恢復(fù)后復(fù)性。第三十二頁，共一百零五頁。2023/2/1433（1）DNA模板的變性

將待擴(kuò)增DNA加熱到950C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈（即：使模板DNA或延伸后的雙鏈DNA發(fā)生熱變性

），并游離于反應(yīng)體系中作為模板；（2）模板與引物的結(jié)合（退火或復(fù)性）

將體系溫度降至合適溫度（550C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補(bǔ)結(jié)合。（由于加入的引物量遠(yuǎn)多于模板量，所以引物與模板的結(jié)合比例遠(yuǎn)大于模板自身的復(fù)性）；第三十三頁，共一百零五頁。2023/2/1434（3）引物延伸

將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補(bǔ)原則連接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸，形成兩條與模板互補(bǔ)的新鏈。

以上為一次PCR循環(huán)（變性、復(fù)性和延伸）

（新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板）按照上述步驟重復(fù)操作，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。模板DNA擴(kuò)增倍數(shù)T=2n(n:循環(huán)次數(shù))。第三十四頁，共一百零五頁。2023/2/1435

PCR技術(shù)原理示意圖第三十五頁，共一百零五頁。2023/2/1436

2.PCR各要素及其作用（1）模板

PCR模板可以是DNA或RNA。以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個拷貝；

RNA作為模板時，需要：

RNAcDNAPCR,稱此為RT-PCR.

（2）耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

是從耐熱細(xì)菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可在95℃穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→55℃退火→71℃延伸]循環(huán)30次過程中不變性失活。在PCR中，TaqDNA聚合酶應(yīng)用最廣泛。

逆轉(zhuǎn)錄第三十六頁，共一百零五頁。2023/2/1437（3）引物

引物是根據(jù)已知序列的模板DNA待擴(kuò)增區(qū)兩端而設(shè)計(jì)的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為1530個堿基。引物是保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和特異性的關(guān)鍵因素，其設(shè)計(jì)與合成對PCR的成功至關(guān)重要。引物設(shè)計(jì)原則如下：第三十七頁，共一百零五頁。2023/2/1438

引物設(shè)計(jì)應(yīng)符合以下基本原則：

①長度適宜，一般為1530個堿基；②G+C含量，一般為40％60％；③4種堿基應(yīng)隨機(jī)性分布；④引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；⑤兩個引物之間不應(yīng)有多于4個堿基的互補(bǔ)；⑥引物3ˊ端不應(yīng)有任何修飾；⑦引物5ˊ可以修飾。第三十八頁，共一百零五頁。2023/2/1439（4）緩沖溶液與Mg2+

PCR技術(shù)常用1050mmol/LTris-HCl、pH8.38.88偏堿緩沖液；并含有一定量的Mg2+濃度；（5）dNTP濃度

PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應(yīng)相等；第三十九頁，共一百零五頁。2023/2/1440（6）參數(shù)變性溫度與時間

一般選擇：940C，30秒退火溫度與時間

取決于引物長度、濃度和G+C含量，一般選擇：Tm-5℃

延伸溫度與時間

一般選擇：70℃

75℃循環(huán)次數(shù)

取決于模板濃度，一般循環(huán)：30次第四十頁，共一百零五頁。2023/2/1441

PCR操作

各種PCR反應(yīng)的操作基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列不同，選擇不同的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)。

將PCR反應(yīng)管置于DNA自動化熱循環(huán)儀上，輸入各種循環(huán)參數(shù)，使DNA擴(kuò)增在熱循環(huán)儀上很方便地完成。

PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時，對樣本質(zhì)量要求不高，能快速、特異地?cái)U(kuò)增任何DNA片斷。

PCR缺點(diǎn)

由于高靈敏度，使易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。

第四十一頁，共一百零五頁。2023/2/1442

3.PCR產(chǎn)物分析（1）凝膠電泳分析法

可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。同時應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并拍照。

（在待檢靶序列拷貝數(shù)多、且僅擴(kuò)增出一條帶時，用此法即可滿足檢測要求。）第四十二頁，共一百零五頁。2023/2/1443（2）點(diǎn)雜交分析法

該法有2種：

①將擴(kuò)增產(chǎn)物直接固定在膜上，每一個探針制備一張膜，然后用不同的特異探針進(jìn)行雜交；②將不同的探針固定在膜上，再用有標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與之雜交。

本法有助于檢測突變DNA類型，用于人類遺傳病診斷合某些基因的分析。

(當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物時多條帶時，用此法更合適。)第四十三頁，共一百零五頁。2023/2/1444（呈2n擴(kuò)增速度）PCR基本過程和原理特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高樣品可以是：毛發(fā)、血痕單細(xì)胞、病原體、腫瘤殘留物、犯罪現(xiàn)場遺留物第四十四頁，共一百零五頁。2023/2/1445基因診斷中常用的PCR技術(shù)：（1）、DNAPCR：（2）、RT-PCR：以DNA為模板，擴(kuò)增特定核苷酸序列。用于檢測特定基因片段的存在，分析鑒定基因突變。以總RNA或mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后擴(kuò)增。用于檢測特定基因表達(dá)水平的主要方法之一。（3）、PCR-SSCP：檢測基因未知突變的常用技術(shù)。簡單、快捷、靈敏。第四十五頁，共一百零五頁。2023/2/1446（4）、多重PCR：指在一次PCR反應(yīng)中加入多對引物，同時擴(kuò)增DNA序列上不同序列片段的一種PCR技術(shù)。用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。（5）、原位PCR：直接用組織切片和細(xì)胞進(jìn)行PCR或RT-PCR，在組織、細(xì)胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特點(diǎn)基因序列。（6）、實(shí)時定量PCR：借助特異性結(jié)合DNA的熒光染料，實(shí)時動態(tài)檢測PCR擴(kuò)增的DNA量的變化。第四十六頁，共一百零五頁。2023/2/1447其他重要的PCR衍生技術(shù)反向PCR（IPCR）標(biāo)記引物PCR（labelledprimersPCR）錨定PCR（anchoredPCR）差異展示PCR（DD-PCR）第四十七頁，共一百零五頁。2023/2/14483、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）檢出方法：Southern印跡概念：用同一限制性內(nèi)切酶完全切割同一物種的不同個體的基因組DNA，出現(xiàn)分子質(zhì)量不同的同源片段，這種由限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)變化導(dǎo)致的DNA片段差異，稱限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）。人類基因組中由中性突變導(dǎo)致個體間核苷酸的差異稱－－DNA多態(tài)性第四十八頁，共一百零五頁。2023/2/1449RFLP類型：2、由于鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入和重排導(dǎo)致DNA順序的變化，因而酶切片段改變－－－序列多態(tài)性。1、單個堿基的突變引起酶切位點(diǎn)的變化－－－點(diǎn)多態(tài)性致病基因附近或內(nèi)部一般存在RFLP，可用于連鎖分析的基因診斷。第四十九頁，共一百零五頁。2023/2/14504、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）

應(yīng)用于基因突變性質(zhì)不明的連鎖分析。AFLP－－串聯(lián)重復(fù)的短片段的長度多態(tài)性通過PCR擴(kuò)增,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后電泳,產(chǎn)生顯示擴(kuò)增片段多態(tài)性。第五十頁，共一百零五頁。2023/2/1451AFLP原理：

首先利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶酶切研究對象的基因組序列，產(chǎn)生不同長度的酶切片段。然后，將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板。為達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，再在模板末端添加具有選擇性核苷酸（1～3個）的不同引物，然后PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對的酶切片段被擴(kuò)增。最后將被擴(kuò)增的片段在高分辨率的測序凝膠上電泳，這樣其多態(tài)性即根據(jù)擴(kuò)增片段的長度與數(shù)量的不同而被分開。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即等位片段之間差別只有幾個bp。第五十一頁，共一百零五頁。2023/2/14525、等位基因特異的寡核苷酸（ASO）方法：1、合成兩種探針：①已知突變位點(diǎn)的核苷酸序列（M）

②正常基因堿基序列（N）2、雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果：M+N-受檢者是突變基因的純合子M-N+受檢者是不存在突變基因M-N-受檢者的缺陷基因可能是一種新的突變類型M+N+受檢者是突變基因的雜合子原理：

已知基因突變部位和性質(zhì)，合成基因特異的核苷酸探針（20bp），標(biāo)記后與受檢者DNA雜交診斷。（可與PCR聯(lián)用：PCR-ASO）第五十二頁，共一百零五頁。2023/2/14536、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。

PCR-SSCP第五十三頁，共一百零五頁。2023/2/1454PCR-SSCP基本過程①PCR擴(kuò)增靶DNA；②將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后快速復(fù)性；③將單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；④通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變。

第五十四頁，共一百零五頁。2023/2/14557、基因芯片（生物集成模片、DNA陣列、或寡核苷酸微芯片）基本原理：指將大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測根據(jù)雜交分子和未雜交分子信號的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。第五十五頁，共一百零五頁。2023/2/1456基因芯片技術(shù)：第五十六頁，共一百零五頁。2023/2/1457目的：檢測外源性基因的侵入目標(biāo)：1、微生物2、病毒如：HIV（致艾滋病AIDS）3、寄生蟲、4、不易體外培養(yǎng)的病原體（毒性大腸桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌）5、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的病原體（克立氏體）四、基因診斷的臨床應(yīng)用:1、在感染性疾病檢測中應(yīng)用第五十七頁，共一百零五頁。2023/2/1458艾滋病與HIV病毒艾滋病由HIV通過接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。HIV特異地侵犯輔助性T細(xì)胞（CD4），引起人體細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致頑固的機(jī)會性感染，惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。HIV感染后，95%感染者5個月可檢出抗體（也有3-4年仍不能檢出抗體）。有必要進(jìn)行PCR技術(shù)檢測。第五十八頁，共一百零五頁。2023/2/1459艾滋病與HIV病毒檢測技術(shù)：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的設(shè)計(jì)：應(yīng)在保守區(qū)（基因：pol,env,gag,tat)病毒特點(diǎn)：HIV病毒由兩條單鏈RNA組成，9.7k/RNA，主要基因結(jié)構(gòu)和組成形式與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，但較之復(fù)雜，故稱復(fù)雜反轉(zhuǎn)錄病毒HIV屬反轉(zhuǎn)錄病毒－－－即單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體。第五十九頁，共一百零五頁。2023/2/1460非典型性肺炎（SARS）由一種新型冠狀病毒（SARS-CoV）引起，多種途徑傳播，傳染性強(qiáng)、高致死率的急性疾病。診斷依靠：流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、放射診斷、血清學(xué)（熒光免疫、ELISA）PCR作為一種靈敏的早期病原學(xué)診斷必不可少（關(guān)鍵是引物的合成）第六十頁，共一百零五頁。2023/2/14612、在遺傳病檢測中的應(yīng)用

產(chǎn)前診斷檢測妊娠8－12周的絨毛DNA或羊水細(xì)胞

PCR診斷一系列遺傳疾病

鐮刀狀細(xì)胞貧血的診斷方法：－RFLP診斷

MstⅡ酶切識別序列：CCTNAGG

切割正常β鏈序列：CCTGAGG

不切割突變序列：CCTGTGG

－ASO探針診斷第六十一頁，共一百零五頁。2023/2/14623、在腫瘤檢測中的應(yīng)用原癌基因生物正常細(xì)胞基因中編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的癌基因抑癌基因

一類抑制細(xì)胞增殖的基因，其失活可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。兩類基因協(xié)同調(diào)控，使細(xì)胞生長處于平衡狀態(tài)。第六十二頁，共一百零五頁。2023/2/1463癌基因激活變化及檢測：1、基因擴(kuò)增：即染色體某區(qū)段基因拷貝數(shù)增加，或癌基因的擴(kuò)增。檢測方法：Southern雜交定量PCR2、基因的過量表達(dá)：包括基因擴(kuò)增基礎(chǔ)上的過量表達(dá)及非

DNA水平的過量表達(dá)。檢測方法：Northern雜交RT-PCR3、點(diǎn)突變：檢測方法為各種基于PCR的方法。第六十三頁，共一百零五頁。2023/2/1464抑癌基因的檢測：SouthernPCR大片段的缺失和點(diǎn)突變*兩個等位抑癌基因突變才能引起腫瘤，需檢出兩個等位抑癌基因。方法：RFLP結(jié)合PCR，進(jìn)行缺失檢測

點(diǎn)突變主要采用PCR第六十四頁，共一百零五頁。2023/2/1465腫瘤標(biāo)志物：指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)或宿主對腫瘤反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。（1）酶類腫瘤標(biāo)志物（2）激素類標(biāo)志物（3）胚胎抗原（4）特殊蛋白標(biāo)志物（5）糖蛋白類抗原（6）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸酰基轉(zhuǎn)移酶（8）多胺免疫組化篩選提高檢出率第六十五頁，共一百零五頁。2023/2/1466法醫(yī)學(xué)鑒定針對人類DNA遺傳差異進(jìn)行的個體識別和親子鑒定。常用技術(shù):DNA指紋分析（VNTR）短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）遺傳特征分析PCR-擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技術(shù)根據(jù)可變串聯(lián)重復(fù)序列（小衛(wèi)星DNA）多態(tài)性

高度的個體特異性第六十六頁，共一百零五頁。2023/2/1467DNA指紋（圖譜）分析：⑴、選擇核心序列作探針，選在核心序列上無切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，酶解樣品，Southernblot得到DNA指紋圖譜。針對可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）（VNTR是判斷個體的遺傳標(biāo)志）⑵、針對VNTR側(cè)翼保守區(qū)序列設(shè)計(jì)探針，用PCR

對該區(qū)擴(kuò)增，電泳得到個體之間長度不同的條帶圖譜。（VNTR片段較長PCR不易擴(kuò)增）。第六十七頁，共一百零五頁。2023/2/1468所羅門的審判：

大家都聽說過所羅門的審判這樣一件故事：兩位婦人都聲稱自己是孩子的母親，于是所羅門就命令一名侍衛(wèi)把那個孩子帶來，要用劍將其辟成兩半分給他們兩，結(jié)果假母親

同意所羅門的判決，而孩子真正的母親卻懇求侍衛(wèi)饒了孩子的性命，她解釋說：“把孩子給了假母親，總比讓孩子慘死好。”當(dāng)然，真假

母親也就水落石出了。第六十八頁，共一百零五頁。2023/2/1469滴骨驗(yàn)親法：

以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內(nèi)，浸入的則被認(rèn)為兩者有血緣關(guān)系，在各種古籍中有多種記錄。三國時代（公園220—280年）謝承著《會稽先賢傳》中的《以弟血滴兄骨》可能是記錄此法的最早的史料：陳業(yè)的哥哥因海難不幸殞命，當(dāng)時一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴(yán)重腐敗而無法辨認(rèn)死者的身份。陳業(yè)就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發(fā)現(xiàn)其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業(yè)就這樣確認(rèn)其兄的尸骨。第六十九頁，共一百零五頁。2023/2/1470合血法：

等到了明代，更是采用了“合血法”來識別親權(quán)。明末清初的檢驗(yàn)書籍中都有相同的記載：“親子兄弟或自幼分離，欲相認(rèn)識。難辨真?zhèn)巍Ｃ鞔坛鲅我黄鲀?nèi)，真則共凝為一，否則不凝也。”第七十頁，共一百零五頁。2023/2/1471第二部分

基因治療（genetherapy)概念：

將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因缺陷和異常基因引起的疾病，達(dá)到治療目的。導(dǎo)入的基因可以與缺陷基因?qū)?yīng)、在體內(nèi)表達(dá)具有特異功能的同源基因、也可以是與缺陷基因無關(guān)的治療基因。概念的擴(kuò)展：凡是采用分子生物學(xué)方法原理，將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，達(dá)到治療目的的方法，都可稱為基因治療。第七十一頁，共一百零五頁。2023/2/1472基因治療策略:總原則：－－直接補(bǔ)替缺陷基因－－抑制非正常基因產(chǎn)物表達(dá)－－間接調(diào)節(jié)機(jī)體本身免疫系統(tǒng)的抗病能力。－－利用外源基因?qū)Σ∽兗?xì)胞造成特異性殺傷第七十二頁，共一百零五頁。2023/2/14731、基因矯正－－將致病基因的堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。2、基因置換－－用正常基因通過體內(nèi)基因同源重組，原位置換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常。3、基因增補(bǔ)－－將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，不去除異常基因，而是通過目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原有功能得以加強(qiáng)。4、基因失活－－利用反義技術(shù)特異封閉基因表達(dá)，抑制有害基因的表達(dá)。5、免疫調(diào)節(jié)－－將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，改變病人免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療的目的。基因治療的策略：第七十三頁，共一百零五頁。2023/2/14746、調(diào)節(jié)性基因治療：導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因，治療基因表答異常的疾病。7、化療保護(hù)性基因治療：導(dǎo)入單相或多相細(xì)胞毒性藥物的抗性基因，使正常細(xì)胞耐受化療藥物的能力大大提高。8、特異性細(xì)胞殺傷性基因治療：利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建特異性殺傷靶細(xì)胞為目標(biāo)的“奇異彈頭”，“彈頭”部分是分子重組的各種生物細(xì)胞毒素，它們以酶催化方式發(fā)揮抑制蛋白合成作用，造成細(xì)胞殺傷。9、生殖細(xì)胞基因治療：生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞補(bǔ)償性治療。第七十四頁，共一百零五頁。2023/2/1475

美國醫(yī)學(xué)家W·F·安德森等人對腺甘脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）的基因治療，是世界上第一個基因治療成功的范例

1990年9月14日，安德森對一例患ADA缺乏癥的4歲女孩謝德爾進(jìn)行基因治療。這個4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產(chǎn)ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球都已經(jīng)過改造，有缺陷的基因已經(jīng)被健康的基因所替代。在以后的10個月內(nèi)她又接受了7次這樣的治療，同時也接受酶治療。經(jīng)治療后，免疫功能日趨健全，能夠走出隔離帳，過上了正常人的生活。

謝德爾，1999第七十五頁，共一百零五頁。2023/2/1476第七十六頁，共一百零五頁。2023/2/1477第七十七頁，共一百零五頁。2023/2/1478一、基因置換第七十八頁，共一百零五頁。2023/2/1479第七十九頁，共一百零五頁。2023/2/1480第八十頁，共一百零五頁。2023/2/1481二、基因添加第八十一頁，共一百零五頁。2023/2/1482三、基因干預(yù)第八十二頁，共一百零五頁。2023/2/1483四、自殺基因治療第八十三頁，共一百零五頁。2023/2/1484第八十四頁，共一百零五頁。2023/2/1485第八十五頁，共一百零五頁。2023/2/1486第八十六頁，共一百零五頁。2023/2/1487五、基因免疫治療第八十七頁，共一百零五頁。2023/2/1488基因治療基本程序:方法：1、體外法（exvivo):2、體內(nèi)法(invivo):將受體細(xì)胞在體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入外源基因，經(jīng)適當(dāng)選擇系統(tǒng)，將重組的受體細(xì)胞回輸患者體內(nèi)，以改善癥狀。（普遍采用）直接將外源基因?qū)塍w內(nèi)有關(guān)的組織器官,使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄、表達(dá)而發(fā)揮治療作用。基本程序：選擇目的基因選擇基因載體選擇靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移外源基因表達(dá)及檢測回輸體內(nèi)第八十八頁，共一百零五頁。2023/2/1489治療基因的來源：1、野生型基因：

單基因缺陷遺傳病基因

反義核酸封閉活化的原癌基因

轉(zhuǎn)入相關(guān)的抑癌基因，抑制腫瘤2、重組DNA和分子克隆技術(shù)，人工合成特異基因。1、選擇治療的目的基因第八十九頁，共一百零五頁。2023/2/1490用于基因治療的基因應(yīng)滿足以下條件：（1）體內(nèi)僅少量表達(dá)就可顯著改善癥狀。（2）該基因的過量表達(dá)不會對機(jī)體造成危害、（3）在抗病毒和抗病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應(yīng)在病毒和病原體的生活史中起重要作用，并且該序列是特異的。第九十頁，共一百零五頁。2023/2/1491理想的載體具有以下特征：1、容易生產(chǎn)

商業(yè)化生產(chǎn)，廣泛應(yīng)用，易運(yùn)輸，易保存2、持續(xù)表達(dá)

一旦轉(zhuǎn)入體內(nèi)，應(yīng)能在一定時間內(nèi)持續(xù)表達(dá)基因產(chǎn)物，或能通過某種方法精細(xì)調(diào)節(jié)其表達(dá)。3、弱免疫源

轉(zhuǎn)入后不應(yīng)引起免疫反應(yīng)。4、組織靶向性

定向輸入某種細(xì)胞。5、包裝容量載體對轉(zhuǎn)染基因的大小應(yīng)沒有限制。6、復(fù)制、分裂和整合能力：特異性定位整合，或以游離基因形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。7、能感染分裂期細(xì)胞和未分裂期細(xì)胞2、選擇基因載體：第九十一頁，共一百零五頁。2023/2/1492基因載體：非病毒載體（裸DNA、脂質(zhì)體）

病毒載體

（反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒）分類：優(yōu)點(diǎn)：大量生產(chǎn)，毒性小，低免疫性缺點(diǎn)：效率低。優(yōu)點(diǎn)：多數(shù)病毒可感染特異細(xì)胞，不易降解，

RNA病毒能整合到宿主染色體，表達(dá)水平高等。第九十二頁，共一百零五頁。2023/2/1493病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移1、逆轉(zhuǎn)錄病毒：正鏈RNA病毒第九十三頁，共一百零五頁。2023/2/1494逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu):基因組組成：（1）5’－帽子；3’－尾巴；（2）每個單鏈RNA含6個區(qū)：

5’-LTR（長末端重復(fù)序列）

Ψ+

（組裝所需的非編碼序列）

gag（編碼衣殼結(jié)構(gòu)蛋白基因）

pol（編碼反轉(zhuǎn)錄酶基因）

env（編碼外殼蛋白基因）

3’-LTR第九十四頁，共一百零五頁。2023/2/1495逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期:1、感染靶細(xì)胞2、利用自身編碼的逆反轉(zhuǎn)錄酶，以RNA為模板合成DNA。3、將病毒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞核4、病毒DNA整合到宿主染色體5、以病毒DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA6、在細(xì)胞中翻譯Gag、Pol和Env蛋白7、形成衣殼，RNA單鏈和反轉(zhuǎn)錄酶一起包裝進(jìn)衣殼。8、形成病毒顆粒并分泌到胞外。第九十五頁，共一百零五頁。2023/2/1496逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒RNA宿主細(xì)胞RTRT逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA雙鏈插入基