重亞硫酸鹽測序操作方案一、樣品收集1、配制2%低熔點瓊脂糖稱取0.02g低熔點瓊脂糖，倒入1.5mL離心管中，隨后加入1mLmPBS溶液，置于100℃金屬浴中反復加熱并顛倒混勻至完全溶解，取出4℃保存待用。2、收集細胞樣品80℃以上熱水浴使低熔點瓊脂糖溶化。向1.5mL離心管底部加入8μL低熔點瓊脂糖，避免產生氣泡。迅速吸取細胞樣品吹入瓊脂糖中，冷卻后加入500μL礦物質油覆蓋。最后將離心管在熱水浴中短暫浸泡使瓊脂糖小球成型，取出-20℃保存待用。二、亞硫酸氫鹽修飾3、配制DNA細胞裂解液：向20mLTE緩沖液中加入100μL的20mg/ml蛋白酶K。4、向含樣品的離心管內加入500μLDNA細胞裂解液，50℃金屬浴8h以上，以消化樣品。5、在上一步消化進行的同時配制轉化液，注意避光亞硫酸氫鈉4.75g雙蒸水4.5mL2MNaOH3.5mL對苯二酚0.138g共計10mL6、消化完成后，將離心管取出，換液清洗使小球變性：0.3MNaOH，500μL，15min，2次；0.1MNaOH，1mL，5min，1次。7、換液加入500μL轉化液，50℃金屬浴8h以上，以轉化樣品，注意避光。8、用TE緩沖液中止轉化，1mL，15min，6次。9、用0.2MNaOH脫磺化，500μL，15min，2次。10、用TE緩沖液中止脫磺化，1mL，15min，3次。11、用雙蒸水清洗，1mL，10min，2次。12、清洗完成，用槍頭吸取瓊脂糖小球轉移至200μL離心管中，-20℃保存待用。三、甲基化基因的PCR13、使用設計好的兩對甲基化特異性引物對轉化后的DNA樣品進行巢式PCR反應。步驟預變性變性退火延伸終延伸降溫溫度94℃94℃55~65℃72℃72℃4℃時間2min30s30s30s2min∞第一輪反應體系25μL，轉化后瓊脂糖小球計為2μLDNA。第二輪反應體系擴大為50μL。試劑25μL反應體系50μL反應體系2×TaqMasterMix12.525RNase-FreeWater8.519ForwardPrimer，10μM12ReversePrimer，10μM12TemplateDNA2214、將第二輪反應產物全量加入膠孔中，跑膠時盡量跑完全程以分離雜帶。在紫外燈下找到目的條帶，快速精確切取，將膠塊放入1.5mL離心管內。四、膠回收15、對膠塊稱重，向離心管內加入3倍膠體積（0.1g=100μL）QGBuffer，50℃金屬浴至膠融化，同批樣品可統一為450μL，以便于離心。16、加入1倍膠體積（150μL）異丙醇，顛倒混勻后將液體移入離心柱離心，13000g，1min。17、倒掉收集管內液體，向離心柱內加入500μLQGBuffer，再次離心，13000g，1min。18、倒掉收集管內液體，加入750μLPEBuffer，靜置2min，再次離心，13000g，1min。19、更換收集管再次離心，13000g，1min，倒置離心柱在濾紙上晾干2min，再插入新收集管。20、將25μLEBBuffer精確加至離心柱中心內膜，靜置3min后離心，18000g，10min。21、取少量收集管內DNA溶液檢測樣品濃度（分光光度計或跑膠檢測），余下-20℃保存待用。微量分光光度計：測定DNA濃度并記錄，連接T載體時稀釋各組至合適的統一濃度。跑膠：取5μLDNA樣品與1μL6×loadingbuffer混合，點樣跑膠檢測目的條帶，依據目的條帶亮度決定連接T載體時的DNA上樣量。（亮1μL；中等2μL；弱3μL）五、克隆測序22、預先制冰，將pMD18-TVectorCloningKit冰上解凍，依次向200μL離心管內添加：高DNA濃度中DNA濃度低DNA濃度T載體1μL1μL1μLDNA樣品1μL2μL3μL雙蒸水3μL2μL1μL共計5μL混勻后，加入5μLSolutionI；再次混勻，放入PCR儀中16℃連接8h。23、在上一步連接進行的同時，配制LB/AMP培養基（1）配制LB液體培養基（200mL）1%(w/v)Tryptone2g0.5%(w/v)YeastExtract1g1%(w/v)NaCl2g定容后，加入200μL2MNaOH將pH值調至7.0，混勻后移入玻璃瓶內。（2）配制LB固體培養基（200mL）再配制200mLLB液體培養基，隨后倒入含3g瓊脂粉的燒杯中，（3）將兩種培養基與玻璃棒、涂板小桿等一同高壓滅菌。（4）高壓后冷卻至40~50℃時，向200mLLB固體培養基內加入200μL100mg/mLAmpicillin,向150mLLB液體培養基內加入150μL100mg/mLAmpicillin，剩余50mL不加Ampicillin。（5）搖勻LB固體培養基，取90mm培養皿分裝，每盤內倒入約20mL。（6）待培養基凝固后，進行涂板。每板加入50μL20mg/mLX-Gal與20μL50mg/mLIPTG，混合后涂抹均勻，避光晾干備用。24、轉化感受肽（1）連接完成后，將10μL樣品全量加入含100μLDH5α感受態細胞的1.5mL離心管內。（2）輕輕混勻后冰上放置30min，42℃金屬浴激發90s，冰上冷卻2min，操作時避免劇烈晃動。（3）加入900μL不含Ampicillin的LB液體培養基，放入搖床，37℃，150g，培養1h以上。25、養菌待搖床上離心管內菌液長好（充滿液體），取100μL菌液滴入凝固的培養基并涂抹均勻。將涂板倒置在搖床內，37℃，避光，保濕，避風，培養12h以上，待菌斑長至直徑1mm左右。此時培養基上白斑可用，藍斑淘汰。可將培養基直接封口，送樣測序，也可進一步挑菌培養。26、挑菌用槍頭挑取單個陽性克隆菌落混入加有1mL含Ampicillin的LB液