ICS11.220F41NY中華人民共和國農業行業標準NY/T549-2002赤羽病細胞微量中和試驗方法Cellsmicroneutralizationtestforakabanedisease2002-08-27發布2002-12-01實施中華人民共和國農業部發布

NY/T549-2002印赤羽病（akabanedisease,又名阿卡斑病）是由赤羽病病毒（akabanediseasevirus）引起的牛、綿羊和山羊的一種多型性傳染病。該病以流產、早產、死胎、晴形產為特征，能引起先天性關節彎曲和積水性無腦癥。本病的病原是赤羽病病毒，屬布尼病毒科布尼病毒屬，病毒表面有兩種糖蛋白(G1和G),它們分別誘導中和抗體和血凝抑制抗體產生。本病的血清學診斷方法為細胞微量中和試驗本標準由農業部畜牧獸醫局提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口本標準起草單位：農業部動物檢疫所。本標準主要起草人：周立橋、李昌琳、封啟民、李其平。

NY/T549-2002赤羽病細胞微量中和試驗方法1范圍本標準規定了赤羽病(akabanedisease)細胞微量中和試驗技術要求。本標準適用于牛、羊赤羽病感染的定性以及免疫群體抗體水平的評估.材料準備2.16孔細胞培養物,移液器(50pL.、200%L)滴頭，尤毒透明塑料膠帶，小試管，2.2Vero細胞或SVP細胞：2.3抗原、標準陽性血清、標準陰性血清。2.4被檢血清，無菌采集·不加防腐劑。3操作方法3.1準備3.1.1取一支已知滴度的赤羽病病毒(AKV）用199細胞培養液稀釋成100TCID./50PL，作為工作濃度抗原。3.1.2被檢血清、標準陽性血消、標準陰性血清均56（滅活30min,用199液做1：4稀釋(即50l.血消加人15041.199液中）3.1.3按常規微量中和試驗法每個樣品接種4孔，每孔分別加被檢稀釋血清和工作濃度抗原各50L..輕輕振藝培養板使抗質與稀釋血清充分混合·將培養板加蓋貿37C培養箱內中和1h.3.1.4每孔滴加SVP細胞或Vero細胞懸液(20萬/ml.)100L,用透明塑料膠帶封板，置37C溫箱內培養.用倒暨顯微鏡觀察細胞病變情況(通常72h內引起細胞病變)。3.2對照設置每次試驗均要設暨標準陽性、陰性血清對照、病毒對照、正常細胞對照和抗原實際用量的回歸滴度對照。3.2.1標準陽性、陰性血清對照，將已稀釋好的標準陽性、陰性血清分別加人培養板4孔內，每孔50PI.，然后各孔加入工作濃度抗原50PL。3.2.2病毒對照：將工作濃度抗原滴加培養板4孔內，每孔50“L,補加細胞生長液50L。3.2.3將以上三種對照置37℃溫箱內1h.然后于各孔內加人100L細胞懸液，置37℃溫箱內培養，72h后在倒置顯微鏡下觀察結果。3.2.4正常細胞對照：于培養板4孔內各加100PL細胞懸液，然后再于各孔補加細胞生長液100L.3.2.5抗原實際用量的回歸滴度的測定：在每次試驗中，應對使用的100TCIDa/50I.抗原進行實際用量的測定，將工作濃度抗原作10倍遞增稀釋到10-,每個稀釋度接種4孔，每孔50L，立即補加細胞生長液50L,置37C溫箱內1h,然后每孔加入100L細胞懸液,計算該