醫學實驗室認可技術要求

PCR專業的關鍵控制點《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛醫發[2002]10號）《醫療機構臨床實驗室管理辦法》（衛醫發[2006]73號）《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號）《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》《臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》

ISO15189準則（CL02）CNAS-GL26醫學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的指南CNAS醫學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的應用說明參考依據概述基因體外擴增檢驗通常稱為PCR檢驗；該檢驗項目是目前我國臨床檢驗項目中唯一一項需要通過衛生部或省級臨床檢驗中心現場技術驗收合格方可開展臨床檢驗的技術準入項目。1范圍本文件規定了CNAS對醫學實驗室基因擴增檢驗領域的認可要求，包括病原體核酸擴增檢驗和病理學檢查等領域涉及的人體基因擴增檢驗。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改單）適用于本文件。GB/T20468-2006《臨床實驗室定量測定室內質量控制指南》衛辦醫政發〔2010〕194號《醫療機構臨床基因擴增管理辦法》CNAS-RL02《能力驗證規則》4管理要求4.1.1從事基于組織/細胞形態學基礎項目檢測的醫學實驗室，應具有病理學診斷資質。5技術要求5.1人員5.1.2基因擴增實驗室（以下簡稱實驗室）操作人員應經過有資質的培訓機構培訓合格取得上崗證后方可上崗。5.1.4實驗室負責人至少應具有以下資格：中級職稱，醫學相關專業背景，二年以上基因擴增工作經驗。5.1.11實驗室應制定員工能力評審的內容和方法，每年評審員工的工作能力；至少每半年評審新員工工作能力，并保存勝任的證據。當職責變更時，應有政策規定對員工進行再培訓和再評審。沒有通過評審的人員應經再培訓和再評審，合格后才可繼續上崗，并記錄。5.1.13實驗室應提供工作人員對患者隱私及結果保密的聲明及簽字。5.1人員在現場評審時要求安排人員比對：

臨床基因擴增檢驗的操作主要是標本處理中的核酸提取步驟，這其中所涉及的又主要是加樣器的使用，盡管操作簡單，但由于均為微量操作，最后擴增放大，因此要獲得穩定可靠的測定結果，操作人員需要一定的專業技術知識和經驗。5.1人員

在現場安排實驗時應考慮到的問題：標本數量：一般5個；標本要求：一份陰性，其余4份一般要盡可能涵蓋高、中、低、臨界等濃度差，了解線性范圍。5.2設施和環境條件(3-1)5.2.1實驗室原則上分四個分隔開的工作區域：試劑貯存和準備區；標本制備區；擴增區；擴增產物分析區。如使用自動分析儀（擴增產物閉管檢測），（c）和（d）區可合并。上述每個區域應有充分空間以保證：

樣本處置符合分析前、后樣本分區放置；

儀器放置符合維修和操作要求；

標本制備區放置生物安全柜、離心機和冰箱等儀器設備；

打印檢驗報告時交叉污染的控制。5.2設施和環境條件(3-3)5.2.6基因擴增檢驗各工作區域應有明確的標記，不同工作區域內的設備、物品不能混用。進入各工作區域應按照單一方向進行，即試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增區→擴增產物分析區。不同的工作區域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區域時，不能將工作服帶出。5.2.7實驗室應有限制進入的標志和措施。5.2.9實驗室應有足夠的、溫度適宜的儲存空間（如冰箱），用以保存臨床樣品和試劑，設置目標溫度和允許范圍，并記錄。實驗室應有溫度失控時的處理措施，并記錄。5.2.10實驗室應有經過培訓的內務管理人員（如保潔人員），實驗室應有地面、臺面的維護、清潔和消毒計劃及相關的記錄。

危險物品的存放及處置應遵守相關法規，并應有相關的使用記錄。5.3實驗室設備(3-1)5.3.1實驗室應制定設備、試劑和耗材的采購、驗收等管理程序，應有根據工作量保證實驗持續進行的試劑/耗材訂購計劃，以及試劑/耗材最低貯存量要求。基因擴增實驗室如從事RNA的檢測，應具有高速冷凍離心機。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時，應配置洗板機并使用洗板機洗板。一次性的加樣器吸頭應帶有濾芯。5.3.2強檢設備按國家相關要求執行，應進行外部校準的設備，可按制造商校準程序進行。對分析設備校準的基本項目至少應包括：加樣系統、檢測系統、溫控系統。應內部校準的輔助設備，實驗室應制定內部校準程序。應定期對PCR儀、加樣器、溫度計和恒溫設備進行校準。校準與檢定校準： 在規定條件下，為確定測量儀器或測量系統所指示的量值，或實物量具或參考物質所代表的量值，與對應的由標準所復現的量值之間關系的一組操作。檢定：查明和確認計量器具是否符合法定要求的程序，它包括檢查、加標記和（或）出具檢定證書。試劑質檢

強調采用患者標本進行試劑質檢的意義：PCR實驗時兩個關鍵步驟：（1）從標本中提取核酸；（2）提取核酸的擴增。商品化的質控品和標準曲線的結果良好，并非能反映提取試劑的質量。樣品序號結果1（老試劑）結果2（新試劑）偏差判定標準結論對數值對數值偏倚%偏倚%

符合/不符合1000%7.5%

符合23.023.12+3.3%7.5%

符合34.584.32—5.7%7.5%

符合46.245.96—4.5%7.5%

符合

58.568.87+3.6%7.5%

符合5.3實驗室設備(3-3)5.3.6PCR擴增儀應配備穩壓電源。5.3.7設備故障修復后，實驗室應對該設備性能進行驗證，必要時需進行校準。實驗室應首先分析故障原因，如果設備故障影響了方法學性能，可通過以下合適的方式進行相關的檢測、驗證（適用于定量項目）：可校準的項目結果超出允許范圍時，實施校準；質控品檢測結果應在質控范圍內；與其他儀器的檢測結果比較，偏差符合附錄A的要求；使用留樣再測結果進行判別，偏差符合附錄A的要求。

特別注意的是：評價故障對之前檢驗結果的影響。附錄A:

基因擴增檢驗項目分析性能標準A.1應不低于國家標準、行業標準、地方法規要求。A.2自建檢測系統不精密度要求：以能力驗證/室間質評評價界限（靶值0.4對數值）作為允許總誤差（TEa），重復性精密度<3/5TEa；中間精密度<4/5TEa。A.3設備故障修復后，分析系統比對：5份樣本，覆蓋測量范圍，至少4份樣本測量結果偏倚<7.5%。A.4實驗室內分析系統定期比對：樣本數n≥20，濃度應覆蓋測量范圍，計算回歸方程，計算系統誤差應<7.5%。A.5留樣再測判斷標準：按照項目穩定性要求選取最長期限樣本，5個樣本，覆蓋測量范圍，至少4個樣本測量結果偏倚<7.5%。A.6沒有標準和室間質評要求時，實驗室間結果比對合格標準可依據制造商聲明的性能標準而制定。1X103

取對數＝3；30.4；0.4/3＝13.33%；1X108

取對數＝8；80.4；0.4/8＝5%。項目CLIA’88基于生物學變異合適性能(%)最佳性能(%)最低性能(%)鉀T±0.5mmol/L5.82.98.7鈉T±4mmol/L0.90.41.3氯T±5%1.50.72.2鈣T±0.25mmol/L2.41.23.6磷T±20%10.25.115.3葡萄糖T±10%6.93.510.4總蛋白T±10%3.41.75.2白蛋白T±10%3.91.95.8肌酐T±15%8.24.112.2尿素T±9%15.77.823.5尿酸T±17%12.46.218.6丙氨酸氨基轉移酶T±20%32.116.048.1門冬氨酸氨基轉移酶T±20%15.27.622.8γ-谷氨酰轉移酶T±20%22.211.133.3乳酸脫氫酶T±20%11.45.717.0堿性磷酸酶T±30%11.75.817.5肌酸激酶T±30%30.315.245.5淀粉酶T±30%14.67.321.9總膽紅素T±20%31.115.546.6三酰甘油T±25%27.914.041.9總膽固醇T±10%8.54.212.7高密度脂蛋白膽固醇T±30%11.15.516.6低密度脂蛋白膽固醇T±30%13.66.820.4載脂蛋白A1T±30%9.14.513.6載脂蛋白BT±30%11.65.817.5pO2T±3sN/AN/AN/ApCO2T±8%5.72.98.6pHT±0.04N/AN/AN/A糖化血紅蛋白N/A4.32.26.5糖化白蛋白N/A7.23.610.8前白蛋白N/A14.57.221.7如何正確采集患者標本，確保分子診斷檢驗結果準確可靠？1、規定標本采集的時間此項規定一方面應便于病人與檢驗人員做好準備，集中收集標本及時檢測，尤其是RNA標本應在采集后及時處理以防RNA的降解。人的汗液，甚至空氣中，都可能含有RNA酶，當RNA遇到RNA酶時會降解，造成檢測結果誤差。另一方面應考慮疾病發展過程中，標本采集過早過晚都可能給出假陰性結果。比如，獲得性梅毒分三期Ⅰ期（初期）梅毒：外生殖器潰瘍滲出物中有大量的TP；Ⅱ期（中期）在梅毒疹與淋巴結中存在大量的TP；Ⅲ期（晚期）病變波及全身組織器官，病損處TP少。2、標本的類型和采集量標本的類型和采集量應根據所檢測的病原體而定，并且重視和考慮同一病原體感染部位不同所采集的標本類型亦不同。比如，肺部結核應取深部晨痰；神經系統結核應取腦脊液；泌尿系統結核應取尿液（清晨一次全部尿量或24小時尿沉渣）；胸腔腹腔結核可取胸水、腹水；另外對于病變部位不明的病人亦可采取血液抗凝。3、標本采集中的防污染措施（1）標本采集采用一次性材料。（2）標本應裝在封閉的無菌一次性容器中。（3）標本應收集在專用的容器內，而不能與其他檢測項目共用同一份標本，因為這樣做大大增加了標本間污染的可能，若是進行RNA檢測的標本易受RNA酶污染。4、標本的抗凝要求一般全血和骨髓標本應進行抗凝處理，EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干擾時除外）；用于RNA（如HCVRNA）擴增檢測的血標本宜進行抗凝處理，并盡快（3小時內）分離血漿，以避免RNA的降解；如未作抗凝處理，則宜在抽血后1小時內分離血清；分泌物、拭子、腫瘤組織等標本留取的注意事項等。基于組織/細胞學形態基礎的檢測項目應由具有病理診斷資質的醫師確認標本是否滿足檢測要求。5、其它注意事項對于取材來自男性尿道或女性生殖道的分泌物或拭子等標本，要特別注意是否取到病變的樣本，否則容易出現假陰性。對這類樣本，臨床上往往存在一個誤區，即臨床醫生希望檢驗科能報告定量的結果，如性病的治療、優生優育檢查。雖然PCR方法本身是可以準確定量的，但因取材無法定量，故此這類檢驗結果實際上無法準確定量。5.6檢驗程序的質量保證(4-2)5.6.3對于定量檢測項目，使用配套分析系統時，實驗室可使用制造商提供的溯源性文件。使用非配套分析系統時，實驗室應采用有證參考物質、正確度控制品等進行正確度驗證或與經確認的參考方法進行結果比對以證明實驗室檢驗結果的正確度。如以上無法實現，則通過如下方式提供結果可信度的證明：參加適宜的能力驗證計劃（PT）、室間質評計劃（EQA），且在近期一個完整的周期內成績合格，或與已獲認可的實驗室或其它使用相同檢測方法的配套系統的同級別或高級別醫療機構實驗室進行比對。5.6檢驗程序的質量保證(4-3)5.6.4實驗室應按照CNAS-RL02《能力驗證規則》的要求參加相應的能力驗證活動。應采用相同的檢測系統檢測質控樣本與患者樣本；室間質評活動需由從事常規檢驗工作的人員執行；應有禁止與其他實驗室之間核對上報PT、EQA結果的規定；應能提供參加PT、EQA活動的結果和證書。實驗室應對“不滿意”和“不合格”的PT、EQA結果建立分析和糾正措施，并記錄。實驗室負責人或指定負責人應監控室間質量評價活動的結果，并在結果報告上簽字。5.6.5對沒有開展PT或EQA的檢測項目，實驗室應通過與其他實驗室（如已獲認可的實驗室或其它使用相同檢測方法的配套系統的同級別或高級別實驗室）比對的方式，判斷檢驗結果的可接受性。5.6檢驗程序的質量保證(4-4)5.6.6實驗室用兩套及以上檢測系統檢測同一項目時，應有比對數據表明其檢測結果的一致性，比對頻次每年至少2次，每次不少于5份樣本，濃度水平覆蓋測量范圍；比對結果的系統偏倚應符合附錄A的要求。使用不同生物參考區間的檢測系統間不宜進行比對。5.6.7實驗室管理層應定期檢查室內質量控制記錄（最少每月一次）和能力驗證結果。應有針對內部質量控制和外部質量評價“不滿意”結果采取糾正措施的記錄。質量控制記錄至少應保留2年。5.6檢驗程序的質量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理核酸的分離純化靶核酸提取的質量臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質核酸樣本制備及擴增檢測的質控產物檢測的質控核酸樣本的制備、擴增檢測及其質量控制5.6檢驗程序的質量保證一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理靶核酸可以與宿主細胞整合，核內游離及胞漿內各種構形存在于細胞內，如測定的是病原微生物,則靶核酸存在于細菌、病毒、原蟲或真菌細胞內，如果上述細胞破裂,則靶核酸亦可存在于細胞外。一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結合于核酸的蛋白質，從而將靶核酸從細胞內釋放出來。5.6檢驗程序的質量保證核酸的分離純化核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增的物質去除。經典方法硅吸附法對于商品核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。5.6檢驗程序的質量保證靶核酸提取的質量純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標準比較測定。核酸提取的產率：可在A260讀數測定。核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用已知病原體含量的溶血和/或脂血標本用待評價試劑提取，然后進行擴增檢測，比較所得到的結果。●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之間●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng總RNA反轉錄的cDNA取1uL5.6檢驗程序的質量保證臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質臨床標本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機溶劑。5.6檢驗程序的質量保證實驗室應有室內質控方案和室間質評計1.室內質量控制標準操作程序；

陽性對照、陰性對照、試劑空白對照、

陽性（臨界值）對照

2.實驗室應參加EQA。失控結果的分析，糾正措施及其效果評價等。5.6檢驗程序的質量保證無商品化質控物時，可采用自制的質控物。質控物的評價：均一性、瓶間差、穩定性等。理想質控物：基質與待測樣本一致；所含待測物濃度接近試驗的決定性水平；穩定；靶值或預期結果已定；無已知的生物傳染危險性；單批可大量獲得；價廉。5.7檢驗后程序檢驗結果的審核；原始樣品及其他實驗室樣品的保存應符合經批準的政策；不再用于檢驗樣品的安全處置應符合廢棄物處置的法規或有關廢棄物管理的規定。5.8結果報告(2-1)檢測結果的報告應準確、清晰、明確和客觀；定性測定報告“陰性”或“陽性”，定量測定則以拷貝數/ml或IU/ml報告，避免二者的混淆；每份報告應包括以下信息：標題，如“檢測報告”、報告的唯一標識（如序號）、被檢測標本的說明、檢測標本的特性和狀態、檢測標本的接收日期和進行檢測的日期、采用的檢測方法、實驗操作及校核人員的簽字及簽發日期、檢測報告中應給出參考結果或范圍（檢測下限）；5.8結果報告(2-2)由于任何原因導致報告的有效性發生疑問時，實驗室應立即通知臨床相關科室予以改正；當臨床科室或患者要求用電話、圖文傳真或其它電子和電磁設備傳送結果時，實驗室應保證工作人員遵循文件化的程序，并為對方保密。定量PCR試驗HCV-RNA使用GBW09151標準物質驗證準確性，定值1.09±0.27×105IU/ml,實測0.79×105IU/ml，偏差27.5%，超出定值范圍，未進行處理（5.6.3）。（0.79－1.09）/1.09*100%=27.5%假定一個靶值為1*104;如果檢測結果為1*103，則（1*103-1*104）/1*104=0.9=90%;如果檢測結果為1*105，則（1*105-1*104）/1*104=9=900%。不符合項案例HBV-DNA可報告范圍為103－108，