概述色譜流出曲線基本原理兩個理論定性與定量第二章色譜基本理論概述色譜法早在1903年由俄國植物學家茨維特分離植物色素時采用。碳酸鈣色素石油醚色譜的兩個相固定相不動的一相流動相攜帶樣品流動的流體當流動相中樣品混合物經過固定相時，由于各組分在性質和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。色譜的分類色譜流出曲線及有關術語流出曲線和色譜峰基線柱中僅有流動相通過時，檢測器響應訊號的記錄值。理想的基線應該是一條水平直線。色譜峰檢測器對流動相中被分離組分的響應訊號的記錄值保留值死時間不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現峰極大值所需的時間。保留時間

試樣從進樣開始到柱后出現峰極大點時所經歷的時間。調整保留時間由于組份的tR包含了組份通過柱子的時間和在固定相中滯留的時間，所以t'R實際上是組份在固定相中停留的總時間。t'R=tR-tM因物質不被固定相吸附或溶解，其流動速度與流動相的流動速度相近。在測定流動相平均線速ū時，可用柱長L與tM的比值計算。tMtR和t'R保留時間和調整保留時間是色譜法定性的基本依據死體積VM指色譜柱在填充后，柱管內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當后兩項很小而可忽略不計時，死體積可由死時間與流動相體積流速F0（L/min）計算：VM=tM·F0

保留體積VR調整保留體積V'R相對保留值r2.1某組份2的調整保留值與組份1的調整保留值之比，稱為相對保留值。

相對保留值只與柱溫及固定相的性質有關，與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關。因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數據。必須注意，相對保留值絕對不是兩個組份保留時間或保留體積之比。選擇因子α在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值。在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分離的物質對，將它們的相對保留值作為重要參數。在這種特殊情況下，可用符號α表示：式中t'R2為后出峰的調整保留時間，所以α總是大于1的。區域寬度標準偏差σ

是組份在色譜柱中譜帶擴張的函數，它反映了色譜操作條件的動力學因素。0.607倍峰高處色譜峰寬的一半半峰寬W1/2峰高一半處對應的峰寬峰寬W

（基線寬度）色譜峰兩側拐點上的切線在基線上的截距峰面積峰高色譜峰頂點與基線之間的垂直距離。從流出曲線上，可得到許多重要信息：

1.根據峰的個數，判斷樣品中所含組份的最少個數2.根據峰的保留值，進行定性分析3.根據峰面積或峰高，進行定量分析4.保留值與區域寬度，是評價色譜柱分離效能的依據5.兩峰間的距離，是評價色譜條件是否合適的依據6.判斷儀器是否正常色譜法分析的基本原理色譜分析的目的：將樣品中各組分彼此分離

組分要完全分離，各峰間的距離必須足夠遠；兩峰間距離是由組分在兩相間的分配系數決定的，即與色譜過程的熱力學性質有關。

兩峰間雖有一定距離，而每個峰都很寬，以致彼此重疊，則也不能分離。峰的寬窄是由組分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質有關。分配系數K和分配比k1.分配系數K

色譜分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復多次地分配、吸附--脫附、離子交換等過程。分配系數是描述分離過程中樣品分子在兩相間分配的參數，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時的濃度之比。

2.分配比k（k′）

在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比

k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，因此又稱容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數；也決定于組分和兩相的熱力學性質，不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，還與兩相的體積有關。

式中CS，Cm分別為組分在固定相和流動相的濃度；Vm為柱中流動相的體積，近似等于柱死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。

分配比k可直接從色譜圖測得設流動相在柱內的線速度為u，組分在柱內線速度為us，由于固定相對組分有保留作用，所以us＜u。此兩速度之比稱為滯留因子Rs。

3.分配系數K與分配比k的關系

其中β稱為相比率，它是反映各種色譜柱特點的又一個參數。如，對填充柱的β值一般為6～35；對毛細管柱的β值為60～600。

4.分配系數K及分配比k與選擇因子α的關系

對A、B兩組分的選擇因子，用下式表示

上述公式表明：通過選擇因子α把實驗測量值k與熱力學性質的分配系數K直接聯系起來，α對兩相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個組分的色譜峰必將重合。兩組分的K或k值相差越大，則分離越好兩組分具有不同的分配系數是色譜分離的先決條件兩個理論和分離度塔板理論

最早由Martin等人提出。把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引人理論塔板數（n）作為衡量柱效率的指標。

iii）所有組分開始時存在于第0號塔板上，且試樣組分沿軸（縱）向擴散可忽略

iv）組分的分配系數在所有塔板上是常數，與其在某一塔板上的量無關

i）在柱內一小段長度內，組分在兩相間可迅速達到平衡。這一小段柱長稱為理論塔板高度（H）

ii）以氣相色譜為例，載氣是脈動而不是連續進入色譜柱的，每次進氣為一個塔板體積（ΔVm）為簡單起見，設色譜柱由5塊塔板組成；某組分的分配比k=2；組分的量為81。0#1#2#3#4#5427815436182718918/1836241224129631682412211260.670.335.332.6716821.3310.6710.675.33ΔV0ΔV1ΔV2ΔV3ΔV40#81=54+2754=36+1836=24+1224=16+8161#27=18+918+18=24+1224+12=24+1224+82#9=6+36+12=12+612+123#3=2+12+64#1由塔板理論可建流出曲線方程：W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。故n和H是描述柱效能的指標。通常氣相填充色譜柱的n＞103，H＜1mm；毛細管柱n=105~106，H＜0.5mm。由于tm包括在tR中，而tm不參與柱內分配，因此n值盡管較大，而H卻很小，與實際柱效能相差甚遠。所以把tm扣除，用有效塔板數neff和有效塔板高Heff評價柱效能。

塔板理論用熱力學觀點形象地描述了溶質在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導出流出曲線的數學模型，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計算和評價柱效的參數。但由于它的某些基本假設并不完全符合柱內實際發生的分離過程。如，未考慮縱向擴散造成譜帶擴張和影響板高的各種因素，也不能說明為什么在不同流速下可以測得不同的理論塔板數。

1956年VanDeemter等提出的色譜過程動力學理論。它吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質過程，在動力學基礎上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣、液相色譜都適用。范氏方程的數學簡化式為：式中u為流動相的線速度；A，B，C為常數，分別代表渦流擴散項系數、分子擴散項系數、傳質阻力項系數。速率理論1.渦流擴散項A

在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒阻礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴散。A＝2λdpA與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規則因子λ有關，與流動相的性質、線速度和組分性質無關。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細管，不存在渦流擴散，因此A＝0。

2.分子擴散項B/u（縱向擴散項）

縱向分子擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構型呈“塞子”狀。隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，必然自發地向前和向后擴散，造成譜帶展寬。

B＝2γDgγ是填充柱內流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。Dg為組分在流動相中擴散系數（cm2·s-1）。3.傳質阻力項Cu由于氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，它們的傳質過程不完全相同。對于氣液色譜，傳質阻力系數C包括氣相傳質阻力系數Cg和液相傳質阻力系數Cl兩項，即C＝Cg＋Cl

。傳質固定液載體對于填充柱，氣相傳質阻力系數Cg為：由上式看出，氣相傳質阻力與填充物粒度直徑的平方成正比、與組分在載氣流中的擴散系數成反比。因此，采用粒度小的填充物和相對分子質量小的氣體（如氫氣）做載氣，可使Cg減小，提高柱效。

液相傳質阻力系數C1為：上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴散系數Dl大，則液相傳質阻力就小。減少固定液的量，可降低df

，但k隨之變小，又會使Cl增大。固定液量一定，df隨載體的比表面積增加而降低。因此，一般采用比表面積較大的載體來降低df，但比表面太大，由于吸附造成峰拖尾，對分離也不利。提高柱溫可增大Dl，但會使k值減小，為有適當的Cl值，應控制適宜的柱溫。將上面各式總結，即可得氣液色譜速率板高方程：液液色譜速率板高方程為：該式與氣液色譜速率方程的形式基本一致，主要區別在液液色譜中縱向擴散項可忽略不計，影響柱效的主要因素是傳質阻力項。

4.流動相線速度以及分子擴散項和傳質阻力項對板高的影響

5.固定相粒度大小對板高的影響

當然，固定相顆粒愈細，柱流速愈慢。只有采取高壓技術，流動相流速才能符合實驗要求。分離度兩峰距離近并且峰形寬；兩峰嚴重相疊，選擇性和柱效都很差兩峰距離雖遠，峰形仍很寬；說明選擇性好，但柱效低分離理想；說明選擇性和柱效均好單獨用柱效或選擇性都不能真實反映組分在色譜柱中的分離情況。既能反映柱效率又能反映選擇性的指標，稱總分離效能指標。它又叫分辨率，其定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即分離度RR值越大，表明相鄰兩組分分離越好當R＜1時，兩峰有部分重疊；當R=1時，分離程度可達98%；當R=1.5時，分離程度可達99.7%。通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。

分離度受柱效（n）、選擇因子(α)和容量因子（k）三個參數的控制。對于難分離物質對，由于它們的分配系數差別小，可合理地假設k1≈k2=k，W1≈W2＝W。基本色譜分離方程式1.分離度與柱效的關系由分離方程式看出，具有一定α的物質對，R直接和neff有關，說明neff能正確地代表柱效能。分離方程式還表明，R與n的關系還受熱力學性質的影響。當兩相和被分離物質對的α確定后，R將取決于n。對于一定理論板高的柱子，R的平方與L成正比。用較長的柱子可以增加R，但延長了分析時間。

提高R的好方法是：制備性能優良的柱子，通過降低H，以提高R。

由基本色譜方程式判斷，當α=1時，R=0。顯然，α越大，選擇性越好。一般通過改變固定相和流動相的性質和組成或降低柱溫，可有效增大α值。

2.分離度與選擇因子的關系3.分離度與容量因子的關系如果設：則分離方程式寫成由圖可看出：當k＞1O時，隨容量因子增大，分離度的增長是微乎其微的。一般取k為2～10最宜。對于GC，通過提高柱溫，可選擇合適的k值，以改進分離度。對于LC，只要改變流動相組成，就能有效地控制k值，對分離能起到立竿見影的效果（見下圖）。4.分離度與分析時間的關系分析時間與分離度呈指數型正相關關系；分離度越大，所需分析時間越長。5.基本色譜分離方程式的應用例1

有一根lm長的柱子，分離組分1和2得到的色譜圖如圖所示。圖中橫坐標為記錄筆走紙距離。若欲得到R=1.2的分離度，有效塔板數應為多少？色譜柱要加到多長？解：先求組分2對組分1的相對保留值r2,1（即α值）求有效塔板數：neff＝16×0.82×[1.1/(1.1-1)]2＝1239若使R=1.2，所需塔板數可計算，即因此，欲使分離度達到1.2，需有效塔板數為2788塊，則所需柱長為：

L=2788/1329×1m=2.25m例2

已知某色譜柱的理論塔板數為3600，組分A和B在該柱上的保留時間為27mm和30mm，求兩峰的峰半寬和分離度。解:∵w1/2=w/1.7WA=27/(3600/16)1/2=1.8mm(WA)1/2＝1.8/1.7＝1.06mmWB=30/(3600/16)1/2=2.0mm(WB)1/2＝2.0/1.7＝1.18mmR＝2(30-27)/(1.8+2)＝6/3.8＝1.6例3

已知物質A和B在一個30.00cm長的色譜柱上的保留時間分別為16.40和17.63min。不被保留組分通過該柱的時間為1.30min。峰寬為1.11和1.21min，計算：

(1)

柱分辨本領；

(2)

柱的平均塔板數目；

(3)

塔板高度；

(4)

達到1.5分離度所需的柱長度；

(5)在較長柱上把物質B洗脫所需要的時間。

解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)nA=16(16.40/1.11)2=3493

nB=16(17.63/1.21)2=3397

nav=(3493+3397)/2=3445=3.44×103(3)H=L/n=30/3445=8.71×10-3cm(4)n2=3445×2.25/1.12=6.92×103

源于n1/n2=(R1/R2)2L=nH=6.92×103×8.71×10-3=60.27cm(5)tR2=tR1(R2/R1)2=17.63×1.52/1.062

=35.44min定性與定量定性分析色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標。但是不同物質在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值。因此僅根據保留值對一個完全未知的樣品定性是困難的。目前各種色譜定性方法均基于保留值在了解樣品的來源、性質、分析目的的基礎上，對樣品組成作初步的判斷，再結合下列的方法進行定性。1.已知純物質對照色譜條件不變，則組分的保留時間是一定值。這是色譜定性分析中最方便，最可靠的方法。如果未知樣品較復雜，可采用在未知樣品中加入已知對照，通過未知樣品中哪個峰增大，來確定未知樣品中的某成分----加標定性法。只適用于組分性質已有所了解，組成比較簡單，且被定性成分有標準品（對照品）。2.經驗規律當沒有待測組分的純標準樣時，用氣相色譜中的經驗規律定性。（l）碳數規律一定溫度下，同系物的調整保留時間的對數與分子中碳原子數成線性關系式中A1和C1是常數，n為分子中的碳原子數（n≥3）。如果知道某一同系物中兩個或更多組分的調整保留值，則可根據上式推知同系物中其它組分的調整保留值。（2）沸點規律

同族具有相同碳數碳鏈的異構體化合物，其調整保留時間的對數和它們的沸點呈線性關系式中A2和C2均為常數，Tb為組分的沸點（K）。根據同族同碳數碳鏈異構體中幾個已知組分的調整保留時間的對數值，可求得同族中具有相同碳數的其他異構體的調整保留時間。有時利用相對保留值定性比用保留值定性更為方便、可靠。用保留值定性時，必須使兩次分析條件完全一致，有時不易做到。而用相對保留值定性時，只要保持柱溫不變即可。方法要求找一基準物質，常選易得純品的，且與被分析組分相近的物質作基準物質，如正丁烷、環己烷、正戊烷、苯、對二甲苯、環己醇、環己酮等。3.相對保留值又稱Kováts指數，重視性較其他保留數據都好的定性參數，可根據所用固定相和柱溫直接與文獻值對照，而不需標準樣品。也是一種相對保留值，它是把正構烷烴中某兩個組分的調整保留值的對數作為相對的尺度，并假定正構烷烴的保留指數為n100。被測物的保留指數值可用內插法計算。

4.保留指數內插法求IX示意圖信號

tR(Z)

tR(i)tR(Z+1)

t進樣例下圖為乙酸正丁酯在阿皮松L柱上的流出曲線（柱溫100℃）。由圖中測得調整保留距離為：乙酸正丁酯310.0mm，正庚烷174.0mm，正辛烷373.4mm，求乙酸正下酯的保留指數。乙酸正丁酯的保留指數為775.6。在與文獻值對照時，一定要重視文獻值的實驗條件，如固定液、柱溫等。而且要用幾個已知組分進行驗證。解：已知n=7色譜與質譜、Fourier紅外光譜、發射光譜等儀器聯用是目前解決復雜樣品定性分析最有效工具之一。5.雙柱、多柱6.與其他方法結合對于復雜樣品的分析，利用雙柱或多柱法更有效、可靠，使原來一根柱子上可能出現相同保留值的兩種組分，在另一柱上就有可能出現不同的保留值。當色譜峰峰型好的時候，有時也采用峰高來進行定量計算。定量分析

定量分析是根據檢測器對溶質產生的響應信號與溶質的量成正比的原理，通過色譜圖上的峰面積或峰高，計算樣品中溶質的含量。

峰面積是色譜圖提供的基本定量數據，現在幾乎都是積分法獲得峰面積。注意積分參數的設定需將面積乘上一個換算系數，使組分的面積轉換成相應物質的量，即Wi=fi′Ai。式中Wi為組分i的量，Ai為峰面積，fi′為定量校正因子。1.定量校正因子fi′定義為：單位峰面積的組分的量。與檢測器靈敏度Si的關系為：fi′=1/Si

定量校正因子同一檢測器對不同物質具有不同的響應值，所以兩個相等量的物質得不出相等峰面積；或者說，相同峰面積并不意味著相等的量。相對定量校正因子由于物質量Wi不易準確測量。實際工作中，以相對定量校正因子fi代替定量校正因子fi′fi定義為：樣品中各組分的定量校正因子與標準物的定量校正因子之比。式中m和A分別代表質量和面積，下標i和s分別代表待測組分和標準物。fi(m)表示相對質量校正因子，由于進入檢測器的物質量也可以用摩爾或體積表示，因此也可用相對摩爾校正因子fi(M)和相對體積校正因子fi(V)表示。

凡文獻查得的校正因子都是指相對校正因子，可用fM，fm分別表示摩爾校正因子和質量校正因子（通常把相對二字略去）。相對校正因子只與試樣、標準物質和檢測器類型有關，與操作條件、柱溫、載氣流速、固定液性質無關。校正因子測定方法：分別準確