病毒的檢測

內容提要病毒的分離與鑒定病毒感染單位的測定病毒顆粒的檢測病毒的血清學檢測病毒核酸的檢測病毒的分離與鑒定病料的采集與準備病毒的分離與培養病毒的理化特性測定病毒的血清學與分子生物學鑒定標本采集殺滅雜菌（青鏈霉素）接種鑒定病毒種型易感動物出現病狀雞胚病變或死亡細胞培養細胞病變三大方法大多數革蘭氏陽性菌都對青霉素敏感（結核桿菌對青霉素不敏感）；而革蘭氏陰性菌則對青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性腦膜炎雙球菌和淋病雙球菌對青霉素敏感），而對鏈霉素、氯霉素等敏感。所以首先區分病原菌是革蘭氏陽性菌還是陰性菌，在選擇抗生素方面意義重大。病料的采集與準備病料采集部位需適當一般可采集發病或死亡動物的組織病料、分泌物或糞便等，采樣因動物及病毒的種類而異。犬細小病毒或輪狀病毒腹瀉的幼犬或犢牛:糞便口蹄疫的豬或牛:水泡液及水泡皮流感病毒:拭子肺臟

病料采集后處理需適當采集的器官或組織樣本如肺臟、腦、肝、脾、淋巴結等，可取一小塊進行充分研磨，加入含青、鏈霉素的Hanks液，離心取上清液作為接種物；分泌物或滲出液、糞便拭子取樣鼻液、膿汁、乳液汁等分泌物或滲出液、糞便，應加入高濃度的抗生素，充分混勻后，置4度冰箱內處理2~4小時或過夜，離心后取上清作接種用；拭子在取樣后應迅速將其浸泡入含有2%犢牛血清和一定濃度的青、鏈霉素的Hanks液中，充分涮洗棉拭子，反復凍融3~5次，離心后取上清液作為接種材料。病毒的分離與培養病毒是嚴格細胞內寄生的生物，所以病毒的培養需要在活體內進行。細胞培養、雞胚和實驗動物原代細胞、二倍體細胞株和傳代細胞系細胞培養相關知識病毒嚴格細胞內寄生，培養病毒必須使用細胞。實驗動物、雞胚都擁有大量活的細胞，可用于病毒培養。尤其是SPF動物或SPF雞胚，目前仍然經常供培養病毒之用，但是發展最快的技術是細胞培養。動物細胞培養一般流程原代細胞（primarycell）對病毒較易感，尤其是來源于胚胎或幼畜組織的細胞。二倍體細胞株（diploidcellstrain）將長成的原代細胞消化分散成單個細胞，繼續培養傳代，其細胞染色體數與原代細胞一樣，仍為二倍體。傳代細胞系（establishedcellline）來源于腫瘤組織或轉化的細胞，染色體數目不正常，為異倍體。HeLa（人子宮癌細胞）、Vero（非洲綠猴腎細胞）、BHK-21（乳倉鼠腎細胞）、PK-15（豬腎細胞）等，并有專門機構負責鑒定和保管，如ATCC等細胞培養的類型細胞培養所需要的一般器材一般營養要求及培養條件培養基：狀態:

液體培養液（動物細胞生活的液體環境）成分:

葡萄糖（滿足能量需求、作為細胞碳源）

氨基酸（合成蛋白質）

無機鹽（重要的細胞組成物質）

維生素、動物血清等（生長調節作用）條件:

恒溫（動物細胞生長溫度）

無菌條件（防止微生物污染）一般還需要一定濃度的二氧化碳血清的作用：

（1）提供有利于細胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養基所缺乏的營養物質。

（2）提供可識別金屬、激素、維生素和脂質的結合蛋白，并通過與上述物質的結合而起到穩定和調節上述物質的作用。此外結合蛋白還可消除某些毒素和金屬對細胞的毒性作用。

（3）提供貼壁細胞固著于適當的附著面所需的貼壁因子和擴展因子。

（4）提供蛋白酶抑制劑，使細胞免受蛋白酶的損傷。

（5）提供PH緩沖物質，調節培養基PH。

（6）影響培養系統中的某些物理特性如：剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等。細胞培養的方法靜置培養（stationaryculture）封閉，靜置于恒溫箱內，數天后細胞可生成貼壁的單層細胞。旋轉培養（rollerculture）不同之處是要培養的細胞不是靜置，而是使之不斷緩慢旋轉（5~10r/h），經過一段時間，細胞可在培養瓶（管）的四壁長滿單層。懸浮培養（suspensiveculture）通過攪拌使細胞處于懸浮狀態生長或維持存活。此法適用于某些不需要貼壁生長的細胞系，如NS-1（一種骨髓瘤細胞系），或作某種特殊研究之用。微載體培養（micro-carrierculture）是在懸浮培養的基礎上，結合微載體的細胞培養技術。微載體是直徑100~35μm的微小顆粒，對細胞無毒性，細胞可貼附其上長成單層。由于微載體數量較大，所獲得的細胞數也比上述常規方法大為增加，對規模化的細胞或疫苗生產很有吸引力，雖則增高了生產成本。細胞培養應用范疇（1）生產有重要價值的蛋白質產品分泌性的蛋白質產品（2）培養皮膚細胞用于移植形成組織（3）檢測有毒物質致癌致畸引起染色體目和結構改變

（4）理論研究:培養正常或異常細胞用于生理、病理、藥理研究

(5)病毒的分離鑒定應用舉例病毒對細胞的選擇性豬傳染性胃腸炎病毒初次分離最好用豬甲狀腺原代或二倍體細胞等培養。PRRSV僅在豬肺巨噬細胞、Marc-145細胞及非洲綠猴腎細胞系MA-104生長

PCV常用PK15細胞培養培養方法常用的有靜置培養和旋轉培養，旋轉培養產率更高大部分的病毒以靜置培養為主如輪狀病毒，初次分離時旋轉培養成功率較靜置培養為高。SARS-CoVinvariouscelllinesRD293HeLaA:正常A72細胞(A72);B:CCV感染后，導致的合胞體細胞(a)及凋亡現象(b)AabB圖3426-1雞胚接種途徑示意圖（據Flint等）雞胚依據不同的病毒種類，選擇適當的接種途徑，通常接種尿囊腔，如新城疫病毒等。特殊情況可接種包括卵黃囊、絨毛尿囊膜和羊膜腔等，如雞痘病毒接種絨尿膜。實驗動物病毒的理化特性測定

病毒核酸型鑒定是病毒理化特性測定的最主要指標。代謝抑制法，即添加氟脫氧尿核苷（FUDR）病毒復制被抑制者，即為DNA病毒，否則為RNA病毒。DNA酶或RNA酶分別作用，以判定核酸的性質。綠豆芽酶（Mungbeannuclease）可降解單股核酸，用它可進一步鑒定核酸是單股或雙股。直接用純化的病毒核酸通過電子顯微鏡觀察PCR核酸測序技術脂溶性試驗用乙醚或氯仿處理待檢病毒液，而后與未處理者比較其TCID50的變化，以判斷是否敏感,從而判定是否為有囊膜病毒空斑試驗病毒樣本接種吸附于單層細胞細胞上覆蓋一層含營養液的瓊脂感染病毒的細胞及病毒擴散的周圍細胞形成空斑或蝕斑（plaque）空斑形成單位（PFU）僅計數含20-100個空斑的培養板。VirusPlaques病毒的空斑（據Madigan等）病毒空斑單層細胞高稀釋度低稀釋度終點稀釋法終點稀釋法（Endpointdilutionassay）用于測定幾乎所有種類的病毒滴度，包括某些不能形成空斑的病毒，并可用以確定病毒對動物的毒力或毒價。使用細胞培養，可通過CPE來判定組織培養半數感染量（TCID50）。病毒顆粒的檢測電子顯微鏡技術

最直觀的方法是用電子顯微鏡（Electronmicroscopy，EM）觀察病毒顆粒。電子顯微鏡觀察法可放大數十萬倍，能觀察1nm的微粒。一些含毒量高的病毒樣本，如糞樣、鼻拭子浸液或組織勻漿液，可用EM檢出病毒。可用磷鎢酸鹽等重金屬鹽直接作負染而后觀察，器官組織樣本則須作超薄切片后再作負染觀察。前者適用于觀察病毒的表面結構如口瘡病毒等，后者則可觀察細胞內的病毒結構，如冠狀病毒、反錄病毒在組織中出芽的病毒顆粒等。血凝試驗（Hemagglutinationassay）許多動物病毒，如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成員，能夠凝集某些種類動物（如雞、小鼠、豚鼠、人）的紅細胞。這些病毒含有可與紅細胞結合的蛋白質，如禽流感病毒的囊膜上有一種稱為血凝素的糖蛋白，可與紅細胞表面的N乙酰神經氨酸糖蛋白結合，引起紅細胞凝集。利用這種特性，可作血凝試驗來檢測這些病毒的存在。一般將病毒液在血凝反應板上作倍比稀釋，加入紅細胞未凝集的紅細胞呈圓點或紐扣狀沉于孔底

凝集的紅細胞彌漫性格狀復蓋整個孔

血凝試驗血凝抑制試驗血清學檢測病毒中和試驗（Virusneutralization）針對病毒的一些蛋白質抗原或抗原表位的抗體與病毒結合后可以中和病毒的感染性。病毒中和試驗可以在細胞培養、雞胚或動物上進行，一般將抗體作稀釋，與一定量的病毒混合，然后檢測其在細胞培養、雞胚或動物上的殘余感染性。終點是以抑制細胞病變（細胞培養）或病毒復制（雞胚或動物）的抗體最高稀釋度來表示。中和試驗具有很強的特異性，是檢測病毒和新分離病毒毒株的鑒定最經典的方法，也可用于檢測病毒感染動物血清中的抗體。補體結合試驗（Complementfixation）補體結合試驗可以用于檢測動物血清中的病毒抗體。病毒抗原與抗體的相互反應可以引起補體結合，最終可導致膜溶解。在補體結合試驗中，利用紅細胞作為靶細胞，溶血系統作為指示系統，因紅細胞膜的溶解易于觀察到。如果存在抗體抗體結合反應，補體結合將發生，后者利用加入結合紅細胞抗體（溶血素）的綿羊紅細胞可以檢測到。如果補體被病毒抗原抗體復合物結合，則紅細胞仍然是完整的；相反，如果補體未被結合，紅細胞將在游離的補體的作用下被溶解。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）酶聯免疫吸附試驗可用于樣本中病毒的檢測和動物血清中病毒特異性抗體的檢測，檢測病毒抗原可采用夾心法和雙夾心法，檢測抗體可采用間接法。病毒核酸的檢測聚合酶鏈式反應

原理:

設計PCR引物，檢測目的片段的大小，DNA測序，比對已知病毒序列。PCR可直接用于DNA病毒的檢測，如果是RNA病毒，則需在擴增之前進行反轉錄，即提取病毒RNA，加入反轉錄酶合成cDNA后，再進行PCR擴增，稱為RT-PCRM123465789101112131415161718192021bp750200010005001099RT-PCR主要適用于RNA病毒的檢測也可用于對DNA病毒等的轉錄水平的檢測核酸雜交

核酸雜交（Nucleicacidhybridization）包括DNA雜交和RNA雜交。前者即Southernblothybridization，用于檢測病毒DNA。RNA雜交即Northernblothybridization，用于病毒RNA的檢測，基本過程與DNA雜交相似。核酸雜交技術可用于細胞、組織中病毒基因組或轉錄本的定位檢測，即稱為原位雜交（insituhybridization）。標本滴加硝酸纖維素膜加熱和堿處理變性標記的核酸探針雜交放射自顯影或其他技術檢測DNA樣本經限制性內切酶消化，凝膠電泳，變性，轉移到濾膜上，然后用放射性同位素標記的病毒核酸序列探針檢測結合到固相濾膜上的DNA。目前放射性同位素標記的核酸探針很少使用，而大多用非放射性標記探針（如生物素標記）進行檢測。一種改良的方法，稱為斑點雜交，可用于樣本中病毒核酸的快速檢測。Southern和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的復性過程，但過程上也有區別，主要是Southern是先電泳后變性，而Northern是先變性后電泳；Southern是堿變性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亞砜等變性，因為采用堿變性會導致RNA水解。Southernblot是分析DNA的雜交技術，Northernblot是分析RNA的，而Westernblot是分析蛋白質的。

SorthernBlot探針是一小段單鏈DNA或者RNA片段（大約是20到500bp），用于檢測與其互補的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為單