第九章：基因敲除與藥學基因敲除技術與諾貝爾獎三位在基因敲除技術方面進行了卓越、開拓性工作并取得了顯著成就的科學家分享了2007年諾貝爾生理或醫學獎，他們是美國鹽湖城猶他州大學的MarieCapecchi教授、美國北卡羅來納州大學的Oliversmithies教授以及英國加蒂夫大學的MartinEvans教授

基因敲除簡介定義：通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。1234567123456790890RNAi同源重組插入突變基因敲除（geneknock-out）通常所說到的基因敲除，又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，把具有功能的同源序列置換出來，造成功能基因的缺失或失活。應用DNA同源重組原理進行基因敲除同源重組插入突變RNAi同源重組插入突變發生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。要有將外援基因導入宿主細胞的載體2.能接受外援基因的受體（常用胚胎干細胞）基因敲除的必備條件基因敲除載體通常，我們將外源基因DNA片段通過相應載體導入ES細胞中，一個好的載體應具備以下特點：能在宿主細胞中穩定存在2.具有多個限制性內切酶的單一酶切位點，即multiplecloningsite(MCS),便于外源基因的插入。常用質粒。3.

具有一個以上的遺傳標志，便于對基因重組的ES細胞進行篩選。常用的篩選標記為正負篩選：Neo（新霉素磷酸轉移酶）基因陽性篩選標記和HSV-tk（單純袍子病毒胸腺嘧啶激酶）基因陰性篩選標記。Neo新霉素基因陽性的ES細胞可以再含有G418（一種新霉素的類似物）的培養基上生長。HSV-tk基因陽性的ES細胞，編碼的基因產物可以將更昔洛韋等轉化為有毒物質，將細胞殺死。胚胎干細胞（簡稱ES細胞）胚胎干細胞是早期胚胎中分離出來的一類細胞，具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。（1）基因敲除載體的構建Step1.獲得目的基因（待敲除基因）的同源片段，將此DNA片段克隆到一般質粒中；Step2.從重組質粒中切除目的基因的大部分同源序列，只留部分序列在線性質粒載體的兩端；Step3.將neo基因和HSV-tk克隆到質粒中；基因敲除的基本程序

根據載體與靶基因組同源序列雙鏈斷裂位點位置的不同，基因載體通常分為兩種：

1．插入性載體(gene-insertionvector)

2．置換型載體(gene-replacementvector)大多數的基因敲除中，采用的是置換性載體；而插入性載體則更多的應用于基因敲入和對目的基因的精確突變。（2）基因敲除載體導入ES細胞

將基因敲除載體導入ES細胞，以載體上的neo基因置換ES細胞基因組的目的基因，從而得到基因敲除細胞

基因敲除載體導入ES的方法有顯微注射法，電穿孔法，DEAG葡聚糖介導法，脂質體法，病毒感染法，精子載體法等1.正負雙向篩選系統（PNS）：Nero基因表達，ES細胞抗新霉素，在G418的培養基中存活。HSV-tk基因表達，在更昔洛韋的培養基中，ES細胞被殺死。

（3）常用的篩選方法有兩類

2.正向篩選

又稱標記基因的特異性表達法，僅有正性選擇性標記的標記基因，而且這種標記方法是缺乏自身的某個表達調控序列。標記基因因為特異整合，獲得調控序列，能夠表達。可以分為無啟動子篩選法，無增強子篩選法，無poly（A）篩選法。

（2）常用的篩選方法有兩類

3．物理篩選方法主要是PCR篩選方法，優點是靈敏，專一性強；。

此外還有富集或篩選率比較高時，可以用Southernblot雜交法，

（2）常用的篩選方法有兩類

（3）基因敲除的ES細胞注射入胚泡（4）胚泡植入假孕小鼠的子宮中導入動物胚胎后，可以發育成嵌合子或完全ES來源的動物。嵌合體動物與正常的動物雜交，子代動物再雜交，有可能產生雜合型突變體。（5）嵌合體的雜交育種

得到純合體：由于同源重組常常發生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。一、條件性基因敲除法：

將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。在傳統基因敲除的基礎上，利用了特異性重組酶系統作為調控的按鈕，實現對基因的時刻可調節敲除。與Cre-loxp重組酶系統有關。第三節：基因敲除進展及前景：

條件性基因敲除優點：

①目標基因的敲除可以限定在特定的組織、細胞或發育的特定階段；

②可避免因基因突變而致死胎的問題：

③在2個loxP位點之間的重組率較高；

④

如用病毒或配體／DNA復合物等基因轉移系統來介導Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉基因動物的過程。

常見的幾種誘導性類型如下：四環素誘導型；干擾素誘導型；激素誘導型；腺病毒介導型。

二、體細胞基因敲除伴隨核移植和體細胞克隆技術的發展，體細胞基因敲除-核移植體系為研究熱點。選擇的體細胞應該有較好的繁殖能力和克隆能力。有時用帶端粒酶基因的DNA轉染細胞，提高細胞的壽命和活力。三、基因捕獲

又稱隨機基因敲除，又稱隨機基因敲除，是隨機插入突變進行基因敲除的一種新型方法。原理：將外源基因（報告基因、標記基因）的載體通過電穿孔或逆轉錄病毒載體法導入ES細胞，并隨機整合到細胞基因組中，建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫。基因誘捕所用的載體一般由報告基因、選擇性標記基因及輔助元件組成。報告基因缺乏自身的某個表達調控序列，在捕獲內源基因的相應表達序列后獲得表達。根據所誘捕的表達調控序列的不同，廣義的基因誘捕包括：增強子誘捕、基因誘捕、啟動子誘捕、poly（A）誘捕。

基因誘捕的優點

利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫，節省大量篩選染色體組文庫以及構建特異打靶載體的工作及費用，更有效迅速地進行小鼠染色體組的功能分析。

基因誘捕的缺點

無法對基因進行精細的遺傳修飾，四、RNAi引起的基因敲除

①、②：雙鏈RNA進入細胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，并在RdRP（以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶RNA）的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。RNAi引起的基因敲除③

：SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物RNAi引起的基因敲除④：上述復合物同與互補的mRNA結合，促進mRNA被RNA酶裂解，并且以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈，并在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。RNAi引起的基因敲除⑤：這些新生成的siRNA也具有誘發RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。五、基因敲除的應用1.基因敲除和轉基因技術是研究基因的結構功能和其他生命科學理論問題的重要工具。2．建立生物模型。

基因敲除技術就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進行相關的研究。這些模型可以是細胞，也可以是完整的動植物或微生物個體。最常見的是小鼠，家兔、豬、線蟲、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見于報道。

3.基因敲除和轉基因技術為人類疾病的基因治療提供有力手段。使用基因工程技術將外源基因導入患者的病變細胞，糾正機體基因缺陷或調節基因表達功能是細胞重新獲得正常的功能，這個過程稱為基因表達。4.基因敲除和轉基因技術通過改造生物體基因，可以用于研制優良的生物反應器，培育新的生物品種和提供異種器官移植的供體動物。隨著基