關于高效液相色譜原理及應用第一頁，共六十四頁，2022年，8月28日自學“薄層色譜法”討論題1.熒光薄層板的組分是什么？它是否用于熒光化合物的檢測？2.熒光薄層的展開動力？展開速度是否發生變化？3.推導容量因子與比移值的關系？4.什么是過壓薄層色譜法？5.薄層色譜掃描儀的工作原理。。。。。。。。第二頁，共六十四頁，2022年，8月28日

HPLC是在經典液體柱色譜的基礎上,在色譜理論指引下，加以改進而發展起來的。特別是GC迅速成為一種儀器分析方法和社會需要分離分析難揮發復雜樣品促進了HPLC的發展。近年來它以6-8%的增長率發展，目前年發表論文數已超過GC。2000年儀器銷售全球第一。第三頁，共六十四頁，2022年，8月28日特性經典LCTLC/PCHPLCHPLC優勢進樣人工加樣點樣進樣器準確溶液流動重力表面張力高壓泵快速分離,重現性好檢測和定量收集餾分檢測顯色連續檢測高靈敏度,自動化實驗結果棒式圖斑點色譜圖五高一廣表11.1三種不同形式液相色譜的這樣特征

第四頁，共六十四頁，2022年，8月28日HPLC和經典LC比較HPLC和經典LC主要差別在于高效固定相、輸液設備和連續檢測。從速率理論得到塔板方程：

渦流擴散、流型效應和停滯流動相慢傳質均與dp有關，小的dp有利于提高柱效。高效固定相的重要特征是顆粒細小。

固定相的慢傳質與df有關，減少df有利于提高柱效。鍵合相色譜有效降低df，柱效進一步提高。第五頁，共六十四頁，2022年，8月28日※經典LC填料的缺陷

填料通常是粒度大、范圍寬、不規則,不易填充均勻,擴散和傳質阻力大,譜帶展寬加大。它存在致命弱點：速度慢、效率低和靈敏度低。※HPLC填料（高效固定相）顆粒細、直徑范圍窄、能承受高壓。達到傳質阻力小,分離效率高。早期HPLC的固定相用涂漬的方法制備，df大，這和GC一樣，會大大降低色譜柱的柱效?，F代HPLC填料多用鍵合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。(高效固定相帶來什么新問題？)第六頁，共六十四頁，2022年，8月28日

使用高效填料帶來兩個新問題：★柱流動阻力大大增大，需要采用高壓泵輸液★表面能很大，采用專業的裝柱技術

目前經典LC主要用于制備，若用于分析則采用脫機或非連續檢測?！鵋PLC的特征

采用高效色譜柱、高壓輸液設備和高靈敏度檢測器,從而實現了高效、高速和高靈敏度、定量準確,達到可與GC相媲美的分離分析性能。特別是結合計算機技術，HPLC已成為高度自動化和智能化的現代分析儀器。第七頁，共六十四頁，2022年，8月28日第八頁，共六十四頁，2022年，8月28日

歷史上出現不同的HPLC名稱：★高壓液相色譜(HighPressureLiquidChromatography)★高速液相色譜(HighSpeedLiquidChromatography)★高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography)

總之，HPLC與經典LC相比,使用時更方便,對操作者的依賴性更小。HPLC的高重現性和連續的定量檢測導致了定性和定量分析結果具有較高的準確性和精密度。經典LC的特點：簡便，填料一次使用。

第九頁，共六十四頁，2022年，8月28日高效液相色譜儀基本裝置流動相進樣閥注入樣品液色譜柱檢測器色譜處理機高壓泵流出液第十頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日高效液相色譜儀方框圖

流動相→高壓泵→進樣器→色譜柱→檢測器→積分儀◎流速控制◎閥進樣◎溫度效應第十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日旋轉式六通閥a)取樣位（load）b)進樣位（injection）第十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日

一般來說，色譜和電泳儀的儀器流程基本相同。從構成儀器的功能塊可分為六大系統：流動相供給和輸送系統、進樣系統、分離系統、檢測系統、記錄或數據處理系統和輔助控制系統。由于流動相的性質不同，流路系統的儀器結構有所不同。但記錄和數據處理系統相同。◆色譜檢測器◆色譜數據處理

第十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日流動相供給和輸送進樣分離檢測記錄、數據處理色譜工作站（計算機）：控制顯示溫度控制收集◆

流路系統（分析單元）：高、低壓流路◆

電路系統（控制單元）：信號傳輸與處理第十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日色譜檢測器（對流出物進行連續檢測）

檢測器實際上是一種換能裝置,它將流動相中組分含量的變化,轉變成可測量的電信號(通常是電壓),然后輸入記錄器。從原理分析，任何一種分析鑒定方法都可能色譜檢測器。理想的檢測器應該是靈敏度高、線性范圍大、對所有待測組分相同響應。一般檢測器分為；●熱學、光學、電學、電化學。。。檢測器●總體性質檢測器：熱導、示差折射、電導溶質性質檢測器：氫焰、紫外、熒光●通用檢測器與選擇型檢測器●濃度型檢測器和質量型檢測器第二十頁，共六十四頁，2022年，8月28日

檢測器的線性、靈敏度和柱外效應三個基本特性直接影響色譜定量分析的準確度、精密度和再現性。

◆檢測器的線性范圍大部分廠商都聲稱它們的檢測器在一定的濃度范圍內是線性響應。實際上檢測器的線性方程可表示為：y=ac,只有在三個數量級的濃度范圍內滿足0.98

1.02的線性響應的檢測器才是線性的。

◆靈敏度色譜分析中有三種不同的靈敏度表示法,檢測器本身的靈敏度,整個色譜體系的濃度靈敏度和質量靈敏度。對于定量分析來說,重要的是色譜體系的靈敏度,因為它還包括柱子和儀器的其它部分的影響。第二十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日

檢測器的靈敏度(CD),實際上指檢測限,即通常指相當于兩倍噪音信號的溶質濃度。而色譜體系的最小檢測限應是柱外效應>10%的最大進樣體積所對應的二倍于噪音峰高所對應的樣品濃度。而色譜分析最重要的是色譜體系的質量靈敏度,最小可測量：

m=2CCD,C是柱內效應的標準偏差。或m=6.25e(1＋k),e是柱外效應的標準偏差。

◆檢測器的色區展寬對于毛細管氣相色譜和高效液相色譜，檢測器的色區展寬是柱外效應的一個主要來源。一般儀器廠商在設計時已把檢測器的色區展寬減少到最低程度。

第二十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日色譜數據處理分離柱檢測器記錄儀積分儀色譜工作站色譜儀信號輸出方框圖色譜數據處理通過ADC轉換器,把模擬信號轉換成數字信號,然后采用色譜軟件處理給出色譜圖等信息。

數據處理原理：◆峰的檢測◆

數據采集◆基線校正和重疊峰的分離

自動處理人工修正第二十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日●峰的檢測

峰的檢測和判別是依據在基線的訊號水平上，預設一個“閾值”，超過該值時，判別為峰可開始檢測。一般采用下面兩種方式判別峰訊號的變化：切線色譜峰的判斷最小面積▲依照信號斜率的變化檢測信號▲依照積分面積檢測峰信號第二十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日

保留時間和峰面積的計算●基線校正和重疊峰的分離

在色譜分析中，經常會遇到基線漂移和色譜峰不能完全分離的情況。通常采用谷—谷規則或預設基線漂移值參數來解決第二十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日

色譜儀自動定性和定量分析

定量計算是把各種計算公式編制成應用軟件存入計算機，通過鍵盤來選擇所需方法。微處理機在定量計算時,一般通過保留值來識別峰。但由于各種因素的影響,在重復多次分析中,保留值會有一定的變化,可采用下述兩種方法確定保留值的變化范圍。◆“時間窗”法(TimeWindow)：tR±Δt

對整個色譜圖上各個峰的保留值都設定相同區間“時間窗”，規定圖中各個峰保留時間的變化范圍。該法設置簡單，但用于識別保留時間相差很近的相鄰峰不大方便?！簟皶r間帶”法(TimeBand):tR(1±a%)

對每個需識別的定量峰，都設定一個保留時間的相對變動范圍。該設置較麻煩，但對不同峰可給出不同的變動范圍，對識別相鄰峰的分辨率較好，同時用于編組定量分析也很方便。第二十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日色譜數據處理機和色譜工作站的差別

色譜數據處理系統/機，積分儀功能：色譜數據處理ADC模數轉換接口

色譜工作站功能：色譜數據處理控制儀器參數ADC和DAC模數轉換接口第二十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日色譜智能化和專家系統簡介

色譜智能化是新一代色譜儀的發展方向,其特點是代替人的部分智能,選擇分析方法和確定最佳色譜條件,并有條件地進行部分組分定性工作。這項工作不僅要求計算機技術,更重要的是,要加強色譜的基礎理論研究,提高色譜操作技術,特別是制備出性能穩定的色譜柱,這樣才能使操作規范化,以實現人工智能色譜。色譜專家系統是色譜智能化的一個重要組成部分,它從人工智能和數值計算方法出發開展研究,應包括以下幾大部分：⑴分離模式和柱系統的選擇；⑵預處理方法和檢測器的選擇；⑶分離條件最優化；⑷在線色譜峰的定性和定量；⑸色譜硬件的診斷。第二十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日色譜柱（固定相、填料）

色譜柱是色譜儀的心臟（起分離作用），其核心是優質固定相（填料）。進行色譜分離的首要工作是選擇性能良好的色譜柱，即在確定的分離條件下分離效率高和分析時間短的色譜柱。

色譜柱的選擇應考慮：固定相類型的選擇,主要取決于樣品分離模式；柱填料的結構,主要指顆粒的形狀大小、均勻性、比表面、平均孔徑和孔容等；柱規格指柱內徑、柱長度和填料粒度

色譜柱的牌號/廠商。第二十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日色譜柱的結構

色譜柱由柱管、填料、密封圈、過濾板、柱頭等組成。應特別注意柱頭規格及無死體積連接的特性。柱規格制備柱分析柱微徑柱液相色譜(MicroboreHPLC)

毛細管液相色譜(CapillaryHPLC)

快速柱：高效短柱，如4.6×30mm,3mODS柱整體柱（Monolithiccolumn)第三十頁，共六十四頁，2022年，8月28日

整體柱(monolithiccolumn)是一種用有機或無機聚合方法在色譜柱內進行原位聚合的連續床固定相,具有制備簡單、重現性好、多孔性優越、能實現快速、高效分離等優點。

制備技術:硅膠整體柱，如Merck公司的ChromolithPerformanceRP-C18、SilicaROD和PrepROD；有機聚合物整體柱，如BIASeparations的CIM(ConvectiveInteractionMedai)等聚合物整體柱

應用：

高效液相色譜(HPLC)、毛細管電色譜(CEC)、微柱液相色譜(μ-HPLC)、固相萃取等系統上,成功地應用于生命科學、藥物學、環境科學等領域的分離分析。第三十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日何為無死體積柱頭連接？無限直徑效應（無限直徑柱）？第三十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日柱填料1．填料的特性1）基質材料①無機基體：硅膠、氧化鋁、氧化鋯和二氧化鈦等②交聯聚合物：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等③復合材料：無機基體復合一層聚合物2）形狀：球形和不規則

硅膠和硅基仍是目前最廣泛應用的液相色譜柱填料。此外還有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、無機金屬氧化物等。第三十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日第三十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日

這類鍵會固定相具有熱穩定好，不易吸水，耐有機溶劑的優點。能在70℃以下，pH2～8范圍內正常工作，應用廣泛.

硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相制備反應如下：（最常見類型?。┑谌屙?，共六十四頁，2022年，8月28日3）粒度及分布范圍4）孔徑和耐壓性

一般硅膠的孔徑在60-125A,但大孔硅膠的孔徑為300-1000A。硅膠填料的產品差異主要取決于：①微?；|的制備過程差異；②基質和鍵合物反應的差異；③柱裝填技術專利的差異。

一些鍵合鍵新技術：（1）RX技術(Txtechnology)“堿性脫活”（2）SB技術(StabilizedBonding)“高覆蓋量”（3）封端技術(End-Capping)第三十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日1）為什么要封端？2）聚合物柱的特點？封端常規聚合物

第三十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日固定相類型(Stationaryphase)1）按色譜保留原理把填料分為：吸附劑、離子交換劑、涂敷固定液、分級孔徑或交聯度填料等。2）按特性分類①硅膠：極性吸附劑②鍵合固定相（為什么要鍵合？）

采用硅膠表面鍵合技術,對硅膠微粒表面進行修飾---硅烷化,使得硅膠表面帶有不同的功能團,以適應不同的分離需要。目前在色譜填料中,鍵合相約占78%(其中C18占反相色譜的72%),硅膠約占10%)。A.

基質：200-300m2/g的硅膠；聚合物,如聚苯乙烯和聚乙烯醇膠等。第三十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日鍵合相類型烷基：C1、C2、C3、C4、C6、C8、C12、C16、C18、C22等反相柱；苯基：C6H5-,含有-相互作用；氰基：-(CH2)3-CN,帶有給電子作用、羥基的氫鍵作用；正相、反相均可。氨基：-(CH2)3-NH2,弱陰離子型鍵合相,可用于糖分析。

其它極性鍵合相還有：二醇基LichrosorbDIOL；硝基Nucleosil-NO2；二甲胺基Nucleosil-NMe2等。C.鍵合層（單層和聚合物）第三十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日柱性能測試:應指定色譜條件和檢測物質1．理論塔板高度2．峰不對稱因子：應小于或等于1.23．相對保留值和分配比的重現性：精密度應優于5%和10%4．柱阻力因子：

=0.1Pt0dp2÷(109L2)，多孔填料500-10005.折合塔板高度第四十頁，共六十四頁，2022年，8月28日流動相(Mobilephase)

流動相（淋洗劑、洗脫劑）是影響液相色譜分離的一個非常重要的實驗因素。改變流動相的性質和組成將改變溶質組分的保留值、分離選擇性和柱效。在實際工作中，流動相的可選擇范圍較大是液相色譜的一個顯著特點。流動相的選擇和優化是大多數液相色譜分析的主要研究工作，在合理的時間內,所用的流動相要能使樣品各組分達到足夠的分離。

1）什么溶劑適合于液相色譜？2）流動相如何影響色譜分離？問題：第四十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日高效液相色譜流動相溶劑的物化性質（部分）第四十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日合適選擇性溶劑液相色譜溶劑選擇范圍

液相色譜流動相溶劑的選擇步驟：●選擇具有合適物理性質的溶劑，如沸點、粘度、紫外截止波長等●選擇合適洗脫強度的溶劑：簡單樣品，2≤k’≤5；復雜樣品，0.5≤k’≤20●改變溶劑的選擇性，使被分離組分具有較高的α值所有溶劑合適物理性質溶劑合適保留值溶劑第四十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日流動相溶劑的選擇

考慮溶劑的實用要求：在實際操作中所選用的流動相能保證色譜系統的分離過程可重復進行：溶劑的純度和化學特性必須滿足色譜過程的穩定性和重復性的要求；溶劑應當不干擾檢測器的工作；在制備分離中,溶劑應當易于除去,不干擾對分離組分的回收。1．與色譜系統的適應性：溶劑要有一定的化學穩定性,不與固定相和樣品組分起反應。2．溶劑的純度（包括毒性和價格）

HPLC級：色譜淋洗劑，波長—透光率

A.R.級：主成分及雜質含量第四十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日3．溶劑的粘度要?。阂话慵s為(0.4-0.5)mPa·s,最大也不超過2mPa·s。粘度大,流動相傳質慢,柱效下降；同時柱壓增大。4．與檢測器匹配：UV檢測要求mp的背景吸收要低,所用溶劑的截止波長(T<10%對應的波長)要與之相匹配。而RI檢測則要求溶劑的折光指數與溶質的差別要大,以利于檢測。5．沸點低：對制備色譜,采用低沸點溶劑時的固體殘留物少,有利于提高純度。6．其他要求：溶劑對樣品要有一定的溶解度。mp用前要脫氣處理。便于更換和清洗。第四十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日液相色譜中的溶劑強度1.

溶劑強度是描述色譜性能的主要指標，表示溶劑對樣品的洗脫能力，它決定于溶劑與溶質之間分子的作用力。目前還沒有一個統一標準描述不同類型液相色譜體系中的溶劑強度，而是采用相對極性和溶解度參數等作為溶劑強度指標。1)

溶解度參數（參見溶劑選擇性）2)

極性參數P’

根據固定相和流動相的極性大小,人們把液相色譜分成：◆正相色譜：固定相極性大于流動相(包括硅膠吸附色譜)◆反相色譜：固定相極性小于流動相第四十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日正相色譜：增加溶劑極性，保留時間增大或變小？反相色譜：增加溶劑極性，保留時間又如何變化？第四十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日洗脫強度與溶劑極性分子之間相互作用有色散力、偶極作用、氫鍵和介電作用。某一溶質與其它分子相互作用大小的程度可以用極性大小表示。極性越大,它與其它分子的作用力越大?！皹O性”溶劑容易吸收和溶解“極性”物質。溶劑洗脫強度指流動相中溶劑的洗脫能力,它不僅與流動相，而且與固定相的極性有關。在正相色譜中,“溶劑洗脫強度”與溶劑極性成正比；而在反相色譜中，溶劑極性越大,洗脫能力越小。第四十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日溶劑強度圖反相色譜THF/H2OACN/H2OMeOH/H2O

020406080100正相色譜

020406080100甲醇戊烷異丙基氯二氯甲烷乙醚乙腈

00.150.30.450.60.75

第四十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日混合溶劑的極性

在液相色譜中,一般溶劑的極性變化二個單位,溶質的分配比差不多能有十倍的變化。通過溶劑強度參數的計算,可以較好地較快地選擇合適溶劑或調整流動相的極性范圍。如：①正相色譜：k2’/k1’=exp[(P1’－P2’)/2]②反相色譜：k2’/k1’=exp[(P2’－P1’)/2]

在液相色譜常用混合溶劑作流動相?；旌先軇┑腜’具有加和性：

P’ab=aP’a＋bP’b,為某一溶劑的體積分數。第五十頁，共六十四頁，2022年，8月28日溶劑選擇性分類

一般地說,改變溶劑比例可調節流動相的極性,從而使得組分的容量因子落在合適的范圍內。但由于分子間相互作用的類型相同,分離因子變化不大。因此專門研究了各種溶劑的選擇性,并將常用溶劑進行分類。第五十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日質子給予體偶極相互作用質子接受體溶劑選擇性分類三角形圖Xe

Xd

Xn12345678純質子接受體強偶極中性化合物純質子給予體第五十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日1組：脂肪醚（純質子接受體）2組：脂肪醇（質子接受-給予體）3組：吡啶衍生物、四氫呋喃（質子接受體，易極化）4組：乙二醇、芐醇、乙酸、甲酰胺（質子給予體）5組：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶極距）6組：脂肪酮、酯、二氧六環、腈7組：芳烴、芳醚、硝基甲烷8組：氟代醇、氯仿、水（質子給予體）第五十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日質子給予體偶極相互作用質子接受體反相色譜中的溶劑選擇性1甲醇2TFH345乙腈67水8第五十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日質子給予體偶極相互作用質子接受體正相色譜中的溶劑選擇性醚1234二氯乙烷5乙腈678CHCl38主溶劑：己烷第五十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日

按溶劑分子的特殊作用類型分類,采用三個不同的常數表示：①Xe(接受質子參數)~易與含羥基的分子作用(如酸類、酚類)；②Xd(給質子參數)~易與堿性化合物作用(如胺、亞砜等)；③Xn(強偶極參數)~易與偶極距較大的溶質分子作用(如硝基化合物、腈、亞砜和胺類等)。通常把常用溶劑分成八組。同一組溶劑的三個選擇性參數相近，其選擇性相似。當某一溶劑不能提供足夠的分離選擇性時,那么更換同組的其它溶劑亦不能提高選擇性。改變溶劑時,只有從距離較遠的溶劑組挑選,才可能使選擇性有較大變化。因為當溶劑和樣品分子的各種相互作用的相對重要性發生明顯變化時,流動相的選擇性才會發生最大程度的改變。第五十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日流動相的優化

流動相的優化主要是考察流動相組成對保留時間、分離因子和分離度等參數的影響。使用混合溶劑最大優點是：獲得最佳的分離選擇性；保持流動相的低粘度,從而保證高的柱效。

在吸附色譜中混合溶劑選擇規則：混合溶劑中極性強的組分含量大或小時,有最大的值；能與溶質發生氫鍵作用的溶劑,有較好的分離選擇性。第五十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日梯度洗脫技術●梯度洗脫的特點●梯度洗脫的主要條件●梯度洗脫的基本原理梯度洗脫（溶劑程序）：通過改變流動相的組成來調整組分的k’值，改變分離因子α值，以達到最短時間內得到最佳分離的目的。為什么程序升溫在液相色譜中沒有受到青睞？

在液相色譜中最低溫度和最高溫度受到流動相的黏度和沸點的限制；同時它的溫度效應比較小。第五十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日1．梯度洗脫的特點（1）改善分離,加快分析速度；（2）改善峰形,減少拖尾,有利于痕量組分的檢測；（3）增加峰容量；（4）強烈滯留的組分不容易殘留在柱上,保持柱性能長期良好；（5）下次分析時,流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異,可能會引起基線漂移。第五十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日2