尿素分子的立體結構土壤中分解尿素的細菌的分離與計數一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農業氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統計菌落數目㈢.設置對照（一）篩選菌株水生耐熱細菌Taq(Thermus

aquaticus

)——耐高溫的TaqDNA聚合酶美國微生物學科布魯克1966年發現耐熱細菌在尋找目的菌株時，要根據它對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。1、實驗室微生物的篩選原理（P21）

人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。（一）篩選菌株2、選擇培養基

在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱做選擇培養基。（一）篩選菌株1.在培養基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質？碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析該配方的培養基對微生物是否具有選擇作用？如果有，又是如何進行選擇的？有篩選作用。尿素是培養基中的唯一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。閱讀22頁本課題使用的培養基配方（二）微生物計數1、顯微鏡直接計數法1mm每一個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計數室的容積為0.1mm3。1mm下面以一個大方格有25個中方格的計數板為例進行計算：設五個中方格中總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，那么，一個大方格中的總菌數是多少?1ml菌液中的總菌數?(1ml=1cm3=1000mm3）

5AB×1045A缺點：不能區分死菌與活菌1、顯微鏡直接計數：利用血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。㈡.統計菌落數目：不能區分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點2、濾膜法

以測定飲用水中大腸桿菌的數目為例。將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養液基上培養。在該培養基上，大腸桿菌的菌落呈現黑色。可以根據培養基上黑色菌落的數目，計算出水樣中大腸桿菌的數量。（二）微生物計數3、統計菌落數目——稀釋涂布平板法酵母菌的菌落特征：菌落形態特征與細菌相似，但比細菌大而厚，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，多數不透明

，容易挑起，菌落質地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落顏色單調，菌落多為乳白色，少數為紅色，個別為黑色。（二）微生物計數注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30——300的平板上進行計數。②涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現的平均菌落數在50個左右為最好。③為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經涂布，培養計算出菌落平均數。④統計的菌落往往比活菌的實際數目低。平板菌落數統計注意事項1、幾個菌落粘連一起，只要肉眼能區分，就算幾個2、不管菌落大小，只要肉眼看得見，就應該計數；3、菌落數目過多時，可以合理采用樣方法。菌落數統計表格（取樣0.1mL,稀釋倍數106）第1組第2組第3組第4組123456平均每mL樣品中活菌數平板組別恰當的稀釋度、正確的涂布操作是成功地統計菌落數目的關鍵。思考1：如何根據平板上的菌落數推測出每mL樣品中的菌株數？

統計某一稀釋度下平板上的菌落數，計算出平板上的菌落數的平均值，然后按公式每mL樣品中的菌株數=（C÷V）×M進行計算。C：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數V：涂布平板時所用的稀釋液的體積M：稀釋倍數思考2：統計的菌落數往往比活菌的際數目高還是低，為什么？

低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統計結果一般用菌落數而不是活菌數來表示。思考3：為了增強實驗結果的說服力和準確性，我們在實驗設計時應該怎么做更合理？

實例分析1

第一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結果不具有說服力。第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂布了三個平板，但是其中1個平板的計數結果與另外2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數值用來求平均值。

實例啟示1、在實驗設計時，一定要涂布至少3個平板作為重復組，才能增強實驗的說服力和準確性。2、在分析實驗結果時，一定要考慮所設置的重復組的結果是否一致，結果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。（三）實驗基本原則1、平行重復原則實例分析2想一想：A同學和其他同學所得實驗結果差異如此之大，請分析原因可能有哪些？①②實例分析2想一想：你能通過設置對照，幫助A同學排除上述兩個可能影響實驗結果的因素嗎？一種方案：可以由其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗。如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養基的配制有問題。實例分析想一想：你能通過設置對照，幫助A同學排除上述兩個可能影響實驗結果的因素嗎？另一種方案：將A同學配制的培養基在不加土樣的情況下進行培養，作為空白對照，以證明培養基是否受到污染。

實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的！

實例啟示設置對照實驗的目的是什么？

排除實驗操作、培養條件等無關變量對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。（三）實驗基本原則1、平行重復原則2、對照原則3、單一變量原則設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。㈢.設置對照：設置對照的方法：空白對照：不給對照組任何處理因素。條件對照：給對照組施以部分實驗因素，但不是所要研究的處理因素。自身對照：對照組和實驗組都在同一研究對象上進行。相互對照：不單設對照組，而是幾個實驗組相互對照。

A同學的結果與其他同學不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；二是由于培養基污染或操作失誤。實驗名稱：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數實驗原理：實驗目的：材料用具：實驗步驟：1、分組編號

2、處理（遵循實驗設計的基本原則）對照原則、單一變量原則（等量原則）科學性原則、平行重復原則可行性原則

3、觀察記錄（設計觀察記錄表）實驗預期：實驗結果的分析與評價：實驗結論：設計時請利用P23-P24的三個資料資料一.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。

將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，充分搖勻，吸取上清液1mL，轉移至盛有9mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。資料

二.樣品的稀釋

由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數為103～107。為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？

答：這是因為土壤中各類微生物的數量是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數約為2185萬，放線菌數約為477萬，霉菌數約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養的條件。思考題

將涂布好的培養皿放在30℃溫度下培養。隨著培養時間的延長，會有不同的菌落產生。

以表格的形式記錄選擇培養基中不同菌落的特征。

資料三.微生物的培養與觀察

[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標記注明培養基種類、培養日期、平板培養樣品的稀釋度等。[三]規劃時間1、結